肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。

MAGE基因mRNA在肺癌细胞中的表达

目的 检测MAGE 1、 2、 3、 4基因在肺癌细胞及癌旁正常肺组织中mRNA的表达水平。方法 用逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)方法对 3 5例肺癌患者肿瘤组织和癌旁正常肺组织进行MAGE 1、 2、 3、 4mRNA表达检测。结果 3 5例肺癌肿瘤标本中MAGE 1、 2、 3、 4的阳性表达率分别为 2 2 .9% ( 8/3 5 )、62 .9% ( 2 2 /3 5 )、3 7.1% ( 13 /3 5 )、77.1% ( 2 7/3 5 ) ;四种基因至少有一种表达的几率是 85 .7% ( 3 0 /3 5 ) ;两种或两种以上同时表达几率是 71.4% ( 2 5 /3 5 )。癌旁正常肺组织四种基因均不表达。MAGE基因的表达在肺腺癌和鳞癌 ,在不同分期的非小细胞肺癌间无差异 ,并且与淋巴结转移与否无关 (P >0 .0 5 )。结论 MAGE 1、 2、 3、 4在肺癌组织中有较高比例的表达 ,癌旁正常肺组织中无表达。

MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义

目的 :检测黑色素瘤抗原基因 1、 3(MAGE 1和MAGE 3)在胃癌中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 :采用RT PCR法 ,对 36例胃癌患者的癌组织和相应的癌旁“正常”黏膜 ,以及 37例慢性胃炎患者的胃镜活检组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因的表达进行研究 ,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果 :36例胃癌组织中 ,MAGE 1基因的表达阳性率为 72 .2 2 % (2 6 / 36 ) ,MAGE 3基因的表达阳性率为 6 9.4 4 % (2 5 / 36 )。MAGE 1、MAGE 3的表达均为阳性者为 5 2 .78% (19/ 36 )。癌旁“正常”黏膜中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率分别为 4 7.2 2 % (17/ 36 )和4 4 .4 4 % (16 / 36 ) ;MAGE 1、MAGE 3基因表达双阳性者为 30 .5 5 % (11/ 36 )。在 37例胃慢性炎症患者中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率 ,分别为 2 9.73% (11/ 37)和 2 7.0 3% (10 /37) ;MAGE 1、MAGE 3基因的表达双阳性者为 8.1% (3/ 37)。胃癌组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因表达阳性率均高于癌旁和胃慢性炎症患者 ;在肿瘤组织中的表达阳性率与肿瘤浸润的深度和分化程度有关 (P <0 .0 5 ) ;而与临床病理分期及淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :基于MAGE 1和MAGE 3基因在胃癌中的高表达率 ,可利用这两种蛋白作为靶?

MAGE-10基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的 探讨MAGE - 10基因与肝细胞肝癌 (HCC)患者临床指标及转移复发的关系。 方法 用RT -PCR的方法测定 31例HCC癌组织及相应癌旁组织和 10例肝硬化组织MAGE - 10基因表达 ,对全部RT -PCR扩增产物中目的基因片段进行DNA测序以证实其为MAGE - 10基因 ,31例HCC测定AFP、岩藻糖苷酶 (AFU)、抗HCV、HBsAg、AFPmRNA、肿瘤直径等临床指标。 结果 31例HCC组织中MAGE - 10基因表达的阳性率为 5 1 6 % (16 / 31) ,明显高于癌旁组织 0 % (0 / 31) ,(χ2 =18 95 ,P <0 0 1)。HCC组织中MAGE - 10基因表达的阳性率与血清AFP、AFU、抗HCV、HBsAg、AFPmRNA水平及肿瘤大小无关 (P >0 0 5 )。 10例肝硬化组织中未见MAGE - 10基因的表达。 结论 MAGE - 10基因在HCC组织中特异高表达 ,其阳性率与HCC患者肿瘤标志物无关。

人肝癌细胞系中肿瘤相关基因MAGE的克隆

目的 克隆人肝癌细胞系HHCC中的肿瘤相关基因MAGE 1的全长cDNA。方法 根据GenBank中MAGE 1基因编码区 ,设计PCR引物 ,用RT PCR方法 ,从人肝癌细胞系HHCC中获得MAGE 1全长cDNA ,双酶切后连接入质粒 pUC19中 ,转化入大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆提取质粒 ,进行DNA序列分析 ,并将测得的核苷酸序列与GenBank中的DNA序列进行BLAST同源性分析。结果 获得MAGE 1全长cDNA、MAGE 6基因 4 6 3bp片段 ,以及 1个与MAGE 6基因编码区有 93%同源性的片段 ,可能为MAGE家族中的新成员。结论 人肝癌细胞系HHCC可表达多种MAGE基因 ,可能有新的MAGE基因出现 ,为研究MAGE基因在HCC中的表达模式及其在HCC免疫治疗中的靶点提供了新的资料。

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的:构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体,建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系(humanhepatocellularcarcinomacellline,HHCC)。方法:利用分子生物学方法,构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3,经脂质体法转染HHCC后,用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达,用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3mRNA的表达。结果:成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后,经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3mRNA转录和EGFP的表达。结论:建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC,为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。

胃癌MAGE-1基因启动子B′B区去甲基化状态的研究

目的 :探讨胃癌组织中MAGE 1基因启动子B′B区去甲基化状态及其与病理分级及临床分期的关系。方法 :取胃癌组织标本 4 0例 ,另外取同患者相应的癌旁组织 4 0例作为对照。采用分子生物学技术 甲基化敏感性内切酶酶切及PCR扩增技术 ,研究了胃癌组织中MAGE 1启动子B′B区的去甲基化状态。结果 :在所检测的胃癌组织标本中MAGE 1基因启动子B′B区去甲基化的发生率为 2 5 % (10 /40 )。而在癌旁组织中发生率为 0 ,两者发生率的差别具有显著的统计学意义 (P <0 0 1)。在低分化腺癌中MAGE 1基因的B′B区去甲化发生率为 5 0 % (6 /12 ) ,中分化腺癌中发生率为 18.7% (3/16 ) ,高分化腺癌中发生率为 8.3(1/11)。其发生率的差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。在早期胃癌组织中B′B区的去甲基化的发生率为16 .7% ,在晚期胃癌组织中发生率为 2 8.6 % (P <0 .0 5 ) ,差别有统计学意义。结论 :胃癌组织中MAGE 1基因启动子的B′B区存在去甲基化。

肝细胞癌患者组织中MAGE-1基因的原核表达及鉴定

目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定。方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Western-blot对其进行鉴定。结果:经RT-PCR扩增出930bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合。结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础。

MAGE基因mRNA在非小细胞肺癌中的表达

目的 :检测 MAGE- 1、- 2、- 3、- 4基因 m RNA在非小细胞肺癌 (NSCL C)中的表达情况。方法 :采用逆转录 -聚合酶链反应(RT- PCR)方法对 2 8例 NSCL C患者的肺癌组织进行 MAGE- 1、- 2、- 3、- 4 m RNA表达的检测。结果 :2 8例肺癌标本中 MAGE-1、- 2、- 3、- 4的阳性表达率分别为 35 .7% (10 /2 8)、4 2 .9% (12 /2 8)、5 3.6 % (15 /2 8)、35 .7% (10 /2 8) ;4种基因至少有一种表达的几率是 89.3% (2 5 /2 8) ;两种或两种以上同时表达几率是 5 7.1% (16 /2 8)。非肺癌患者肺组织 4种 MAGE基因表达均为 0 %。结论 :非小细胞肺癌中 MAGE- 1、- 2、- 3、- 4基因高表达 ,非肺癌肺组织无表达 ,提示 MAGE基因可用于肺癌的主动免疫治疗。

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的 扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法 采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论 成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。

卵巢癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表达的研究

目的:观察卵巢上皮性癌组织及细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、BAGE、GAGE基因的表达,以探讨基因表达与诊断、治疗及预后的关系,评价基因产物作为卵巢癌标志物以及卵巢癌免疫治疗靶位的可行性。方法:采用RT-PCR分析10例正常卵巢2、0例卵巢良性肿瘤、47例卵巢上皮性癌组织及3种卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1中MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2及BAGE基因mRNA水平的表达。结果:正常卵巢组织中MAGE、GAGE、BAGE基因无表达,良性肿瘤中仅有MAGE-1基因表达,阳性率为15%(3/20)。卵巢癌组织MAGE-1、MAGE-3的表达率较高,分别为51.1%(25/47)、34%(16/47),GAGE-1/2及BAGE基因在卵巢癌组织中的表达率分别为25.5%(12/47)和14.9%(7/47)。卵巢癌转移灶仅有MAGE-1、BAGE基因表达,阳性表达率分别为28.6%(2/7)、14.3%(1/7)。浆液性囊腺癌MAGE-1、MAGE-3基因阳性表达率明显高于其它类型卵巢恶性肿瘤(P<0.05)。结论:肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因在卵巢癌中有较高表达,其表达与有无淋巴结转移无关,MAGE-1、MAGE-3基因的阳性表达与肿瘤分化程度及临床分期密切相关,伴有腹水的卵巢癌患者BAGE表达的阳性率较高。卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、COC1的表达谱不尽相同,但至少有一种基因表达,其可作为卵巢癌免疫治疗的特异性靶点。

睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆及表达人胶质瘤特异性抗原MAGE E1基因片段。方法 :从人胶质瘤细胞系BT 32 5提取总RNA ,用RT PCR从中扩增出MAGE E1基因片段。将MAGE E1基因片段插入载体pGEM Teasy中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆至表达载体 pGEX 4T 2中 ,构建重组表达载体pGEX 4T 2 MAGE E1,并转化大肠杆菌进行表达。结果 :用 1mmol/L异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 5h ,MAGE E1蛋白的表达即达高峰。SDS PAGE及凝胶密度扫描分析表明 ,表达出Mr 约 4 10 0 0大小的蛋白 ,占菌体总蛋白的 35 %。结论 :该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体 ,以及制备肿瘤疫苗奠定了基础。

MAGE-1基因在人食管癌中的表达及基因克隆

目的研究 MAGE- 1基因在人食管癌中的表达 ,分析 MAGE- 1抗原能否作为食管癌的治疗性候选疫苗。方法采用 RT- PCR方法检测了 MAGE- 1基因在 30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达 ;并从食管癌组织中扩增了 MAGE-1c DNA全长序列 ,经酶切后与 p ET- 30 a(+ )质粒载体连接 ,经初步酶切鉴定后 ,进行 DNA序列分析 ,获得克隆基因的核苷酸序列。结果 MAGE- 1基因在食管癌组织中的表达率为 43% (13/30 ) ,在 30例相应癌旁正常组织中未见表达 ;成功地克隆了MAGE- 1c DNA全长序列。结论由于 MAGE- 1基因在食管癌中高频率表达以及 MAGE- 1抗原具有 HL A- I类分子限制性CTL 识别表位 ,因此 ,MAGE-

MAGE-1与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的 构建结核杆菌HSP70与肿瘤抗原MAGE-1的融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并通过GST纯化系统进行分离纯化。方法 利用PCR方法扩增TBHSP70基因,经测序后连入原核表达载体pGEX-4T-1,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因片段(289～927 bp),测序后插入TBHSP70基因的5’端,构建NAGE-1与TBHSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-MACE-1-TBHSP70,含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了TBHSP70基因与MAGE-1基因片段,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;成功地构建了pGEX-MAGE-1-TBHSP70原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌DH5α经IPTC诱导后表达一M_r约为125000的蛋白,经GST融合蛋白表达系统纯化,得到了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白。结论 成功地获得了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白,为研究MACE-1-TBHSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。

MAGE-1基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的:研究MAGE-1基因在肝细胞肝癌组织中的表达,结合临床资料分析,探讨MAGE-1基因与肝细胞肝癌(HCC)患者临床指标及转移与复发的关系,为MAGE-1基因编码蛋白用于HCC患者免疫治疗提供依据。方法:用RT-PCR的方法对31例HCC患者癌组织及相应癌旁组织MAGE-1基因表达进行检测,随机对6例RT-PCR扩增产物中目的基因片段进行DNA测序以证实其为MAGE-1基因,所有患者均测定并统计AFP、AFU、抗HCV、HBsAAg、AFPmRNA、肿瘤直径等临床指标。结果:31例HCC患者肝癌组织中MAGE-1基因表达的阳性率64.5％(20/31)明显高于癌旁组织2％(1/31),P<0.01。HCC患者肝癌组织中MAGE-1基因表达的阳性率与患者AFP、AFU、抗HCV、乙肝标志物、AFPmRNA、肿瘤直径等临床指标均无关,P>0.05。结论:MAGE-1基因在HCC患者肝癌组织中特异高表达,HCC患者肝癌组织中MAGE-1基因表达的阳性率与HCC患者AFP、AFU、AFPmRNA肿瘤转移、复发均无关。

以MAGE A1-A6亚型基因mRNA为特异标记检测肺癌细胞

目的探讨肺癌患者痰液及外周血中黑色素瘤抗原基因(MAGE)A1-A6亚型mRNA的表达及其对早期肺癌的诊断意义。方法应用巢式RT-PCR技术,对23例肺癌病人、8例肺良性病变者和10例健康人的痰液及外周血中MAGE A1-A6亚型基因的mRNA表达进行检测。结果23例肺癌病人中7例检测到痰液脱落细胞中有MAGE A1-A6亚型基因mRNA表达,检出率30.4%(7/23);9例检测到外周血有表达,检出率39.1%(9/23);痰液和外周血肺癌细胞联合检出率为47.8%(11/23),大于痰液细胞学检查检出率17.4%(4/23)(P<0.05)。而肺良性病变者和健康人中均未检测到MAGEA1-A6亚型基因mRNA的表达。结论MAGE A1-A6亚型基因的mRNA可作为检测肺癌患者痰液和外周血癌细胞的标记物,两者联合检测有助于提高肺癌的检出率。

人黑素瘤抗原MAGE-A4对p53转录活性的影响

目的:探讨人黑素瘤抗原-A(melanoma antigen-A,MAGE-A)对p53转录活性的影响。方法:选用p53缺失型人肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告分析法、RT-PCR、Western印迹法、克隆形成实验和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)等方法研究MAGE-A4对p53转录活性的影响。结果:荧光素酶报告分析结果显示,转染p53基因(25ng)可以使p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达增加(P<0.01);共转染恒定量(25ng)的p53基因和不同量的MAGE-A4基因(100、200和400ng)后,p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达均明显高于单独转染p53基因时的表达量(P<0.01)。RT-PCR和Western印迹法检测结果也显示,转染p53基因可以使p21WAF1mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因后,p21WAF1mRNA和蛋白表达水平均明显高于单独转染p53基因时的表达水平(P<0.01)。克隆形成实验及TUNEL染色结果显示,转染p53基因可以使H1299细胞克隆形成数减少及凋亡细胞数增加(P<0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因以后,H1299细胞克隆形成数与单独转染p53基因组相比减少,而凋亡细胞数与单独转染p53基因组比较增加(P<0.01)。结论:MAGE-A4可以增强p53的转录活性及功能发挥。

CT、病理和MAGE基因在诊断非小细胞肺癌淋巴结转移的对照研究

目的:比较CT、病理和MAGE-1、-2、-3、-4基因在诊断非小细胞肺癌(NSCLC)淋巴结转移中的意义。方法:采用CT、病理和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测黑色素瘤抗原(MAGE)基因3种方法对53例患者的111组淋巴结分别进行癌转移的检测。结果:80组常规病理检查阴性淋巴结中4种MAGE基因至少有一种表达的淋巴结有19组,几率是23.8%(19/80)。31组常规病理检查阳性淋巴结标本中4种MAGE基因至少有一种表达的几率是87.1%(27/31)。非肺癌患者淋巴结4种MAGE基因表达均为0。应用常规病理检查和应用RT-PCR技术检测MAGE基因在淋巴结微转移阳性率分别为27.9%(31/111)和41.4%(46/111),差异统计学意义(P<0.05)。31组CT阳性淋巴结标本中4种MAGE基因至少有一种表达的几率是80.6%(25/31),80组CT阴性淋巴结中4种MAGE基因至少有一种表达的淋巴结有21组,几率是26.3%(21/80)。结论:应用RT-PCR检测MAGE基因可检出常规病理方法和CT未能检出的淋巴结微转移。

MAGE-A3基因及其产物在肾透明细胞癌组织中的表达

目的:探讨肿瘤特异性黑色素瘤抗原(MAGE-A3)基因mRNA及MAGE-A3蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测45例肾透明细胞癌患者癌组织(新鲜标本,T1期14例,T2期12例,T3期11例,T4期8例;G118例,G215例,G312例)及其中10例患者癌旁组织MAGE-A3基因mRNA表达;Western-blot技术检测上述组织中MAGE-A3蛋白的表达。结果:45例肾透明细胞癌组织中,24例(53%)MAGE-A3 mRNA表达阳性,10例癌旁组织表达均阴性;21例(47%)MAGE-A3蛋白表达阳性,10例癌旁组织表达均阴性。肿瘤不同分期、不同分级之间MAGE-A3基因mRNA及MAGE-A3蛋白表达的差异均无统计学意义(Pearsonχ2检验法,P>0.05)。结论:MAGE-A3基因在肾透明细胞癌中有较高表达,可望成为肾透明细胞癌特异性免疫治疗的靶基因。

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究

目的构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3(CRT/MAGE-A3)双基因重组腺病毒载体,并进行体外表达研究。方法从表达质粒pcDNA3/CRT中切取目的片段CRT,定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV。根据Genbank中提供的黑素瘤基因序列,设计并合成引物,以人肺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段,测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至PacⅠ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi。结果目的片段CRT转入穿梭载体后,酶切鉴定pShuttle(-ΔGFP)-CRT正确。人肺癌组织经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,测序证实为MAGE-A3 DNA后,克隆至穿梭载体pShuttle(-ΔGFP)-CRT构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3,酶切鉴定证实构建正确。酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT/MAGE-A3病毒载体,酶切鉴定证实构建成功。转染293LP细胞并用Western blot检测到其体外表达。结论成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT蛋白及MAGE-A3蛋白。