新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。

树突状细胞负载MAGE-n表位肽的体外免疫学效应研究

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV体外诱导特异性CTL的能力及其抗肿瘤效应。方法:MAGE-n表位肽以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞,用成熟的DC负载MAGE-n表位肽QLVFGIEVV反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性,并用抗HLA-A2分子单抗进行杀伤抑制实验。结果:用DC负载MAGE-n表位肽QLVF-GIEVV可诱导特异性CTL反应,对MAGE-n阳性表达细胞有较强的杀伤作用。结论:DC负载抗原肽QLVF-GIEVV在体外可诱发较强的特异性免疫反应。

肝癌MAGE-n抗原HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测

目的 预测肝癌MAGE -n抗原HLA -A2限制性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)表位。方法 应用SYFPEITHI超基序多项式法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法 ,筛选MAGE -n抗原HLA -A2限制性CTL表位。结果 筛选到MAGE -n抗原 5个HLA -A2限制性CTL表位 (九肽 )。结论 SYFPEI

MAGE-n的原核表达与分离纯化

目的 构建MAGE n的原核表达质粒 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并通过谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS trans ferse,GST)纯化系统进行分离纯化。方法 用ANTHEPROTV5 .0软件预测MAGE n的生物学特性 ,从中选择抗原性及特异性较强的一段。利用PCR方法扩增MAGE n基因片段 ,连入原核表达载体pGEX 4T 1,构建MAGE n的原核表达质粒pGEX MAGE n并测序。将该质粒转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了MAGE n基因片段 ,测序结果表明与GenBank公布的序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE n原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopro pyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达一Mr 约为 4 30 0 0的蛋白 ,经GST融合蛋白纯化系统纯化 ,得到了MAGE n的重组蛋白。结论 首次获得了新的肿瘤抗原MAGE n的重组蛋白 ,并进行分离纯化 ,为进一步研究MAGE

增强型绿色荧光蛋白与MAGE-n共表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)与人黑色素瘤抗原-n(melanomaantigenn,MAGE-n)真核共表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达。方法采用酶切法从pLXSN-MAGE-n中得到MAGE-n基因片段,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建真核共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n。用脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中EGFP的表达,RT-PCR、Westernblot和免疫组化分别检测阳性克隆中MAGE-nmRNA和蛋白的表达水平。结果从pLXSN-MAGE-n重组质粒中酶切获得一条约950bp的片段,成功构建了真核共表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-n,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见到EGFP的表达,产生明亮的绿色荧光,RT-PCR检测到MAGE-nmRNA的表达,Westernblot和免疫组化检测到MAGE-n蛋白的表达。结论成功构建了共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n,获得了稳定共表达EGFP和MAGE-n的小鼠黑色素瘤B16细胞系,为进一步研究MAGE-n在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。

肿瘤相关基因MAGE-n的发现及研究进展

黑色素瘤抗原-n(MAGE-n)基因是本实验室从肝癌细胞系中克隆得到的MAGE家族新成员,该基因与已报道的MAGE家族基因不同,但与MAGE-A家族基因具有同源性,与MAGE-6、MAGE-3同源性最高。我们分别检测了MAGE-n在不同组织、细胞中的表达和分布情况,结果发现:在正常肝组织、肝硬化组织及其它非肿瘤组织中未检测到MAGE-n的表达,而在肝细胞癌、胃癌等恶性肿瘤组织中表达率较高,且在其他不同肿瘤中的表达水平有差异。后续研究筛选鉴定出了HLA-A2限制性CTL表位,体内外实验均显示出良好的抗肝癌免疫效应。MAGE-n的这种表达模式和免疫特性与MAGE家族其他基因相同,提示其可作为肿瘤免疫治疗,尤其是肝癌免疫治疗的靶分子,为肝癌的免疫治疗研究提供新的策略。现就MAGE-n的研究进展作以下综述。

肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测及合成鉴定

目的 采用表位重建技术 ,对预测MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位结合活性进行研究。方法 用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法 ,筛选新的MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位作为候选表位。对预测的抗原表位进行多肽合成 ,并用HPLC进行纯化 ,质谱法 (MS)鉴定。候选表位与HLA A2位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、T2结合稳定性实验及MHC 肽复合体稳定性实验测定。结果 用表位预测法筛选MAGE n抗原 5个HLA A2限制性CTL表位为候选表位。QLVFGIEVV(15 9 16 7)、IMPKTGFLI(195 2 0 3)和FLIIVLVMI(2 0 1 2 0 9) 3个表位具有较高的HLA A2结合力 (IC50 <15 μM)和结合稳定性 (DT5 0 >6h) ,可作为MAGE n抗原HLA A2限制性CTL候选表位进行进一步研究。结论 表位预测结合表位重建方法可提高肿瘤抗原CTL表位研究的效率。MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位经免疫学鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 ,为临床肝癌特异性治疗奠定基础。

联合表位肽诱导HLA-A2^+人PBMC产生抗原特异性CTL及杀伤活性研究

目的:探讨MAGE-3,MAGE-n抗原表位体外联合诱导的CTL,并研究其特异性杀伤活性。方法:候选抗原表位以固相多肽合成技术合成,并用HPLC进行纯化,质谱法(MS)鉴定,以流式细胞仪筛选HLA-A2+人外周血PBMC,T2细胞负载抗原肽反复刺激活化诱导抗原特异性CTL,LDH检测其杀伤活性。结果:联合表位肽体外刺激人PBMC,能够较强地诱导抗原特异性CTL并产生特异性杀伤。结论:MAGE-3与MAGE-n的HLA-A2限制性CTL表位肽的联合应用能够产生较强的体外抗肿瘤免疫反应。

葡多酚对小鼠DNA与染色体放射性损伤的防护作用

目的 探讨葡多酚对辐照诱发的 Ｄ Ｎ Ａ 与染色体损伤的防护作用。方法 将小鼠经口灌胃给予不同剂量葡多酚，采用６０ Ｃｏ γ射线全身照射１ 次，照射后第２ 天检测各组动物的脾细胞 Ｄ Ｎ Ａ 损伤、骨髓嗜多染红细胞微核率和肝脏丙二醛（ Ｍ Ｄ Ａ） 含量３ 项指标。结果 同阳性对照组比较，各试验组的 Ｄ Ｎ Ａ 损伤程度、微核率和 Ｍ Ｄ Ａ 水平均有不同程度降低。经ｔ （ 或 χ２） 检验，差异均有显著性意义（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。结论 葡多酚对放射线照射引发的 Ｄ Ｎ Ａ 和染色体损伤有良好的防护作用。