磁性氮化碳复合材料的制备及其对磷酸化肽的富集

蛋白质的磷酸化在细胞信号传导和疾病发生发展中起着重要作用,但磷酸化的动态变化和低丰度的特点使得对其直接分析有着较大的困难。为了解决磷酸化肽难离子化、检测丰度低的瓶颈问题,本研究制备了一种磁性氮化碳复合材料,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),建立了一种对复杂样品中低丰度磷酸化肽富集与分析的方法。采用电子显微镜、红外光谱分析及X射线衍射分析等手段对合成的磁性氮化碳材料进行表征。以酪蛋白酶解产物为实验模型,发现磁性氮化碳材料能够实现对磷酸化肽的高选择性富集和高灵敏度检测,检出限为0.1 fmol。选择脱脂牛奶、人唾液和人血清为实际分析样品,发现磁性氮化碳材料对微量蛋白生物样品中磷酸化肽的分析具有较高的应用潜力。

半夏炮制过程中毒性凝集素蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)受灵敏度和重复性的影响,对完整蛋白的定量分析存在困难。本研究采用纤维素纳米晶体(CNC)辅助MALDI-TOF MS,结合内标法定量分析半夏炮制过程中半夏凝集素(PTL),通过优化CNC辅助样本制备的时长和比例,以麦胚凝集素(TVL)为内标,直接分析不同炮制程度半夏各炮制品及其浸泡上清液中PTL含量。结果表明,CNC辅助MALDI样本制备有效提升了MALDI-TOF MS定量分析的线性和重复性。随着炮制时间的延长,姜半夏、清半夏和法半夏炮制品的PTL含量逐渐下降,浸泡上清液中PTL含量逐渐上升。其中,由于pH值的改变,法半夏炮制品浸泡上清液中PTL含量呈先上升后下降的趋势。此外,将该方法应用于不同饮片生产企业的多批次半夏炮制品饮片中,均未检出PTL。该方法操作简便,可有效分析半夏炮制过程中PTL含量的变化,为研究半夏炮制过程对PTL的影响提供了参考。

MALDI-TOF MS法快速鉴定散装即食食品中3种食源性致病菌

本研究旨在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)快速检测并鉴定散装即食食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌。通过对点样方式、前处理方式、不同培养基及培养时间等各项实验条件的优化筛选确定最佳方法,并考察其检测限和稳定性,同时用所建立的方法与多重PCR法、VITEK 2等生化鉴定法进行结果比对,比较三者鉴定结果的一致性,最后进行批量食品样本检测来探寻MALDI-TOF MS鉴定法在散装即食食品中的适用性。结果表明,三种目标菌同一批次及不同传代次数的鉴定得分均大于95%,变异系数均小于2%,所建立的方法重复性和稳定性良好,且检测限为10^(5)CFU/mL,MALDI-TOF MS菌株鉴定结果与多重PCR法、生化鉴定法结果高度一致,且比二者检测用时更短,更加特异高效;在点样方式上,相较于夹心法与混合干滴法,三种覆盖法点样平均鉴定得分更高,均为99.9%,其中1μL+1μL覆盖法点样可获得的平均峰数目更多,特征峰更复杂且强度更高;而在前处理方式上,甲酸乙腈法与其他两种菌体处理方法相比可获得更多的出峰量和更高的峰强度,平均鉴定得分均在98%以上,且与数据库中图谱匹配度更高。综上所述,MALDI-TOF MS法在致病菌鉴定方面不仅灵敏特异、准确快速,且操作简便、结果直观,作为国标法的有力补充,为食源性致病菌的分析鉴定与分型溯源提供了新思路。

矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力的验证与分析

通过参加外单位组织的矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证,探索减少过滤后菌落数的计数方式和范围,提高实验室应用GB 8538—2022进行检测的能力,同时验证MALDI-TOF MS的准确性。依据组织方的作业指导书对样品进行处理,采取25 mL+225 mL的方式进行稀释,根据GB 8538—2022进行检测,同时应用MALDI-TOF MS进行鉴定。样品23-V717、23-H802报告结果的评价Z值分别为-0.1、-0.9,皆为满意。此方式提高了实验员检测水平,验证了借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定的准确性,缩短了检验检测时间。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法同时快速测定保健食品中的降压物质

建立了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)同时快速筛查测定盐酸可乐定(HCD)、阿替洛尔(ANL)和利血平(RSP)等3种降压物质的方法。对比了不同点样方式、激光强度对3种药物信号强度的影响等因素,并进行方法学验证。结果表明,以α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)为基质,采用混合点样法,反射线性正离子模式下选择激光强度为60%进行MALDI-TOF MS检测时,3个目标物的质谱信号稳定,强度高,响应重复性好。方法学验证结果表明,3种小分子降压物质在10~100 ng/mL线性范围内线性好,相关系数(r)≥0.99,方法的筛查限(LOI)为0.005~0.25μg/g,在液体、固体和半固体3种保健食品基质中的加标回收率为67.56%~104.70%,相对标准偏差(RSDs)为0.43%~10.51%(n=3)。该方法灵敏度好,准确性高,精密度优,抗干扰能力强,有机溶剂消耗少,节能环保,尤其适用于大批量、多批次保健食品中降压物质的检测,填补了传统基质分析筛查保健食品中小分子非法添加物的空白。

基于蛋白指纹图谱的阳澄湖大闸蟹真伪鉴别研究

蟹螯肌肉组织蛋白质种类丰富,以不同强度的质谱峰出现在质谱图中,提取蟹鳌肌肉组织蛋白,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术,对蟹鳌肌肉组织蛋白质谱进行特征指标分析,找到特征指标,可实现蟹鳌肌肉组织蛋白定性定量检测。通过分析蟹鳌组织蛋白的MALDI-TOF MS图谱规律,解析不同品类螃蟹蛋白质分子指纹图谱,并配合机器深度学习算法对数据库进行深度分析,建立阳澄湖大闸蟹的同源性分析方法。结果表明,不同生长环境的大闸蟹蟹鳌组织蛋白质谱图有不同的表达。m/z(质荷比,mass-to-charge ratio)范围在10000内均有明显差异,扫描结果显示,低质量区(m/z<10000)出峰强度较高且分辨率较高,该区域可以作为区分阳澄湖大闸蟹与其他类别湖蟹的质谱分辨区。以上结果表明,可以通过MALDI-TOF MS技术对不同产地大闸蟹的差异性蛋白质的表达进行分析,从而鉴别大闸蟹的产地。

聚酮合酶基因岛在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行研究

目的 研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的聚酮合酶(PKS)基因岛的临床分布情况,探讨PKS基因岛与肺炎克雷伯菌感染的关系。方法 收集234株肺炎克雷伯菌,根据有、无PKS基因岛分为PKS+组和PKS-组。采用聚合酶链式反应(PCR)检测PKS基因岛,并结合肺炎克雷伯菌感染患者的临床资料,分析其在临床样本中的分布情况。结果 234例感染者中,PKS+组感染者占37.6%(88/234)。菌株主要来源于痰液(70.1%,164/234)、血液(7.3%,17/234)、腹水(5.6%,13/234)和脓液(4.3%,10/234)。PKS+菌株感染者中患有肝脓肿的比例较PKS-菌株感染者多[(13.6%,12/88)vs(1.4%,2/146),P<0.001]。药敏实验发现,PKS+菌株在氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和复方新诺明的药物敏感性更高(P<0.001)。结论 PKS+感染者数量有进一步上升的趋势,肝病患者更易感染PKS+肺炎克雷伯菌,而PKS+菌株对多种抗生素的敏感性较PKS-菌株高。应高度重视PKS基因在肺炎克雷伯菌流行的可能性,并进一步发掘PKS基因在肺炎克雷伯菌感染中的诊疗价值。

MALDI-TOF质谱仪在血培养中的应用

目的评估MALDI-TOF质谱仪在血培养中的应用,探究MALDI-TOF质谱仪对血培养阳性报告时间(TTP)的影响,尽可能缩短TTP,及早终止临床错误用药,提供正确治疗方案。方法收集2021年12月至2022年4月中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院的104份标本,统计TTP以及标本周转时间(TAT),同时进行MALDI-TOF质谱仪和WalkAway96plus仪细菌鉴定结果比对。另对2022年3月和5月共53份阳性血培养瓶原液,利用十二烷基硫酸钠(SDS)和皂素进行标本前处理,直接比对两者的优势,选最优试剂。结果与WalkAway96plus仪鉴定相比,MALDI-TOF质谱仪鉴定的共104株菌株(57株革兰氏阴性菌和47株革兰氏阳性菌)的属种水平完全相符,每个样本的置信度均大于99.9%,无错误鉴定,总得阳性符合率是100%(104/104)。WalkAway96plus仪正确的属鉴定率为84.6%(88/104),正确的种鉴定率为68.3%(71/104)。MALDI-TOF质谱仪对菌株的属、种鉴定水平均优于WalkAway96plus仪,差异有统计学意义(P<0.05)。结论用SDS进行标本前处理,结合MALDI-TOF质谱仪,使得TTP大大缩短及血培养鉴定流程更加优化,为临床提供更好服务。

MALDI-TOF-MS鉴定成人颅内感染人型支原体1例

人型支原体是一类没有细胞壁、具有多形性、可通过滤菌器的已知最小原核型微生物。在人体中,其主要引起泌尿生殖系统感染,而在成人颅内感染中极为少见,且引起的颅内感染在诊断、治疗、预后管理等方面尚缺乏统一的共识。本文报告1例成人因车祸伤行神经外科手术后出现人型支原体颅内感染的病例,旨在为临床此类疾病诊治提供参考。

MALDI-TOF MS在不同禽肉动物源性成分检测中的研究

[目的]建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术检测不同禽肉动物源性成分的方法,构建不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,对不同禽肉进行鉴别。[方法]样品用磷酸盐缓冲液提取,净化后用MALDI-TOF MS法测定。采用ChemPattern软件对不同禽肉蛋白图谱进行化学计量学分析,建立识别模型。[结果]鸡、鸭、鹅3种不同禽肉之间具有明显差异。首次建立不同禽肉蛋白质分子指纹图谱标准数据库,可一次性对每个样品中鸡、鸭、鹅等肉源性成分进行同时分析。[结论]建立的基于蛋白质组学的鸡、鸭、鹅源性成分鉴定系统具有简便、稳定、准确、重现性好的优点,适用于不同禽肉中鸡鸭鹅动物源性成分的鉴别。

氮掺杂芦丁基碳点作为MALDI-TOF-MS基质对氨基酸的检测

以芦丁为碳源、乙二胺为氮源,采用水热法制备氮掺杂芦丁基碳点(N-CD)。通过优化温度、时间、碳源质量等反应条件得到N-CD荧光最大值。将N-CD作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)基质对氨基酸进行检测。结果显示:氮原子在N-CD中主要以吡啶氮形式存在,氮原子的孤电子对与碳点的sP2芳香体系以垂直形式构成的共轭结构,增大了共结晶电子解吸/电离效率。使用N-CD对谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸进行检测。检测结果表明氨基酸离子信号强度最高可达30382。N-CD溶液作为基质最佳质量浓度为0.5 mg/mL,最大耐盐度为1 mol/L,初步实现对人体血清中氨基酸进行高通量检测。N-CD作为MALDI-TOF-MS新型基质材料在分析化学检测、环境检测以及生物小分子检测中具有良好的应用潜力,也为多元素掺杂生物质碳点材料作为MALDI-TOF-MS基质提供了参考。

胃癌患者外周血miR-34a甲基化的检测及临床意义

目的探讨胃癌患者miR-34a甲基化在胃癌发生中的作用以及与临床病理特征、幽门螺杆菌(HP)感染的相关性。方法运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术检测31例胃癌患者和24例对照组外周血DNA miR-34a基因甲基化水平。结果胃癌中miR-34a甲基化水平高于对照组,miR-34a CpG_5,CpG_12.13在胃癌中平均甲基化率高于对照组(51.7%±5.9%vs.37.8%±7.8%,84.61%±8.2%vs.68.1%±12.1%,P<0.01)。miR-34a CpG_5在淋巴结转移组中的甲基化率要高于无淋巴结转移组(53.55%±4.86%vs 47.22%±6.07%,P<0.01),且CpG_5在TNM分期(Ⅱ期+Ⅲ期)中甲基化水平高于Ⅰ期(53.21%±4.8%vs 46.57%±6.9%,P<0.05)。结论miR-34a高甲基化可能参与了胃癌的发生和发展。

温敏核不育水稻花药蛋白质组初步分析

采用固相pH梯度 SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对温敏核不育水稻 96 4 2S可育与不育条件下减数分裂期花药总蛋白进行了分离 ,通过银染显色 ,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱 .PDQuest 2DE图像分析软件可识别约 10 0 0个蛋白质点 .蛋白质点在 2D胶上的重复性为 :沿等电聚焦方向偏差为 1 4 5± 0 2 3mm(n =8) ,沿SDS PAGE方向偏差为 :1 15± 0 17mm(n =8) .对两种育性不同样品的 2D胶上部分共有的蛋白质点 ,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (matrixassistedlaserdesorption ionizationtimeofflightmassspctrometry ,MALDI TOF MS)进行了肽质谱指纹图分析 .通过采用PeptIdent软件对SWISS PROT数据库的查询 ,有 5 0个蛋白质点在数据库得到归属鉴定 .对育性不同的2种样品 2D较上明显差异的蛋白质点进行了分析鉴定 .在不育变化为可育的过程中 ,明显表达上调的蛋白质点包括几丁质酶 ,酸性磷酸酶 ,胞浆激酶 ,谷蛋白前体 ,以及ESTSC72 61蛋白 ,明显下调的蛋白质包括β expansin前体 ,谷氨酸氨甲酰转移酶和

双向凝胶电泳-飞行时间质谱法分析人肺鳞癌细胞NCI-H520蛋白质组成分

目的：建立和优化肿瘤蛋白质组研究的方法系统，并分析人肺鳞癌细胞蛋白质组。方法：用固相 ｐＨ梯度双向凝胶电泳分离人肺鳞癌细胞系ＮＣＩ－Ｈ５２０总蛋白，银染显色，ＰＤＱｕｅｓｔ ２ＤＥ软件分析，对部分蛋白质 点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｙｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱，用 ＰｅｐｔＩｄｅｎｔ软件查询 ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ数据库。结果：获得了分辨 率和重复性均较好的双向电泳银染图谱，图像分析探测到３块胶的平均蛋白质点数为（１１４６±１１６），平均匹配的点 数为（８５１±９５），匹配率达 ７３． ７％， ３ 块胶在蛋白质点位置上具有较好的重复性， ＩＥＦ方向的平均偏差为（１． ５２± ０．２２）ｍｍ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方向的平均偏差为（１．９７ ± ０．１３）ｍｍ。随机取６０个蛋白质点进行胶内原位酶解－质谱指纹图 分析得到了５４个蛋白质点的肽质指纹图，查询数据库初步鉴定了４４个蛋白质，其中部分是与细胞周期有关的蛋 白，部分是与信号传导有关的蛋白。

柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。

基于高压液相色谱法的地沟油聚类分析方法研究

目的建立基于高压液相色谱法的地沟油聚类分析方法,对地沟油进行行之有效的测定。方法假设目标油样的主要成分分为甘油三酯和其他杂质两大类,通过对其MALDI-TOF质谱峰的分析及高压液相色谱峰(HPLC)的聚类判别,实现地沟油的分析检测。首先利用MALDI-TOF质谱对油样进行初步分析;然后根据出峰时间选取了14个特征高压液相色谱峰,得到其面积百分比,并对其进行标准化处理;采用聚类分析技术将41个已知油样聚成六大类,建立样品数据库;对未知样品数据进行判别分析,可以对其进行检测。结果该方法可以检测到食用油中掺入10%的地沟油含量。将该方法用于26个盲样,结果显示,准确率为92.3%。结论该方法可以对地沟油进行有效地测定。

温度对人肺癌细胞A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P_1、P_2、P_3。对差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析和采用SWISS-PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P_1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P_2可能为一种新蛋白,P_3为锌指蛋白11A。

“双甲酸夹心”快速样本前处理方法的建立及在丝状真菌质谱鉴定中的初步应用

目的解决布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱仪在临床微生物学实验室丝状真菌鉴定中样本处理技术操作繁琐,耗时较长的弊端,建立一种快速、简便的丝状真菌质谱鉴定样本前处理方法。方法以2017年1月~2018年3月陕西省人民医院门诊及住院患者临床标本分离到的各种丝状真菌为研究对象,采用"双甲酸夹心"法进行上机前处理,即于96孔不锈钢靶板上用无菌微量吸头滴加1μl甲酸,再选取培养基上生长的丝状真菌菌落(幼龄菌丝体最好)用蘸取少许甲酸溶液的无菌牙签挑取菌丝体与甲酸溶液混合并进行充分研磨,待其自然干燥后在其表面再次滴加1μl的甲酸溶液,干燥后再加1μl基质液(仪器配套),待干燥后即可上机。对检测结果采用形态学和基因测序方法进行确证。结果新建方法前处理鉴定的丝状真菌有曲霉菌、青霉菌、拟青霉、镰刀菌、皮肤癣菌、接合菌、暗色真菌、双向真菌,并且对一些形态不典型或少见丝状真菌都能正确鉴定到种,如裂褶菌、红色单囊菌等。共鉴定菌株158株,其中113株可鉴定到种,31株鉴定到属,无法鉴定14株。结论新建立的丝状真菌样本快速前处理方法,大大缩短了样本前处理实验流程,具有快速、简便、高效、极低实验成本、鉴定正确率较高的特点,可快速为临床提供丝状真菌鉴定结果,使患者得到及时有效的抗真菌治疗。

枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素变异体的纯化和鉴定

利用 6mol LHCl沉淀枯草芽孢杆菌B2菌株的去细胞培养液 ,甲醇抽提获得脂肽类抗生素粗提物 ,过SephadexLH 2 0层析柱获得粗纯化物 ,经MALDI TOF MS检测表明B2菌株仅含有表面活性素一种脂肽类抗生素。利用HPLCSMARTSYSTEM ,将粗纯化物过 μRPCC2 C1 8层析柱对表面活性素变异体进行分离后获得纯化物。经MALDI TOF PSD MS对纯化物的结构分析表明 ,B2菌株的表面活性素变异体由 1 3、1 4和 1 5个碳原子的脂肪酸链以及L Glu L Leu D Leu L Val L Asp D Leu L

气体绝缘开关设备电缆终端绝缘硅油老化问题试验研究

气体绝缘开关设备（GIS）高压充油电缆终端绝缘硅油随运行时间的增加会逐渐老化,从而造成电缆终端的绝缘性能大大降低。为了进行硅油老化状态的判定,首先研究了热老化对硅油电气性能的影响,然后采用针板电极对硅油进行了放电老化试验,通过不同放电形式下击穿电压、介质损耗角正切（简称介损值）、体积电阻率等电气参数的变化规律以及MALDI-TOF质谱分析的结果来评价硅油的老化状态。综合以上分析,证明了单纯的热老化对硅油电气性能的影响较小且非常缓慢,并且初步形成了硅油老化状态的评价标准：若击穿电压U≥40 kV,介损值tanδ≤0.6%,体积电阻率ρ≥5×1012Ω·m,质谱分析表明没有明显低分子量聚硅氧烷生成,则硅油处于轻微老化状态;若击穿电压U为30~35 kV,介损值tanδ为1%~1.5%,体积电阻率ρ为1011~1012Ω·m,质谱分析表明分子量在1 400~2 400范围内时出现稳定间隔吸收峰,则硅油处于中度老化状态;若击穿电压U≤25 kV,介损值tanδ≥5%,体积电阻率ρ≤1010Ω·m,质谱分析表明分子量在550~750甚至更低范围内时出现稳定间隔吸收峰,则硅油处于严重老化状态。