角膜混浊小鼠突变候选基因Map3k1克隆与序列分析

对具有角膜混浊表型的B6-Co突变系小鼠突变候选基因Map3k1进行克隆及测序分析,寻找该突变系小鼠Map3k1基因的突变位点。以小鼠Map3k1基因的mRNA、全长及上游5 kb序列设计引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术分段扩增目的基因,将目的片段连接在T载体上,转化至感受态细胞,筛选阳性克隆,质粒DNA分子提取,电泳检测,EcoRⅠ酶切释放目的片段,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。成功扩增出Map3k1基因的20个外显子和上游调控序列,B6-Co小鼠测序结果与基因组数据库序列比对,该基因位于13号染色体第112 559 574的碱基由T突变为A,编码的蛋白质第314氨基酸由亮氨酸变为谷氨酸,但是该基因的表达调控及蛋白质剪切机制仍有待深入研究。

干扰MAP3K1基因对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

研究旨在探讨促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1,MAP3K1)基因对体外培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞(HFSCs)增殖和凋亡的影响。针对MAP3K1基因设计3个干扰靶点,构建pDNA316-ZsGreen-ShRNA腺病毒干扰载体。转染HFSCs,以空载体细胞为对照,RT-qPCR技术检测干扰MAP3K1效果及增殖相关基因(PCNA、CDK1、CCND2)、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)表达水平,CCK-8和EdU法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果表明,shRNA(MAP3K1-sh)转染HFSCs后,MAP3K1基因相当表达量极显著下降(P<0.01);增殖相关基因mRNA表达水平显著下降,促凋亡基因Bax的mRNA表达水平显著提高,相反,抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达显著降低;CCK-8和EdU结果发现细胞增殖受抑制,S期细胞数量显著上升;细胞总凋亡量显著上升。综上,干扰MAP3K1基因表达显著抑制HFSCs增殖并促进其凋亡,研究为阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛分子形成机制提供科学参考。

9例46,XY完全性性腺发育不全患者分子遗传学分析

目的·分析9例46,XY完全性性腺发育不全(complete gonadal dysgenesis,CGD)患者的遗传学病因。方法·应用SRY基因测序、二代测序(next generation sequencing,NGS)和染色体微阵列(chromosome microarray,CMA)等分子诊断技术综合分析9例46,XY CGD患者的基因变异情况。结果·9例46,XY CGD先证者中检出4例携带SRY基因突变,其中2例携带未见报道的SRY基因致病/疑似致病突变,分别为SRY缺失突变和c.208T>C (p.Trp70Arg)错义突变;2例携带已报道的SRY基因致病突变,即c.169C>T (p.Gln57X)和c.264dup (p.Glu89fs*15)。NGS检测出1例MAP3K1基因杂合突变c.1016G>A (p.Arg339Gln),该突变为疑似致病突变。有2例散发病例经NGS检测、CMA分析未发现致病性拷贝数变异(copy number variations,CNVs)。有2例为家族病例,通过对父母为近亲结婚的两姐妹中的妹妹进行全外显子组测序,在筛选纯合区域的纯合变异后未发现明确的致病突变或可能与性发育相关的变异;CNVs分析发现两姐妹DMRT1基因内含子2中有约14 kb纯合缺失(Chr9:866,388-880,086,hg19),扩增覆盖断点的PCR测序显示健康双亲为杂合缺失携带者;而后采用PhastCons软件对内含子的缺失序列进行保守片段分析,发现2个保守的非编码元件(conserved non-coding elements,CNEs)。结论·SRY基因突变是46,XY CGD较常见的遗传学病因;发现2个新的SRY基因致病/疑似致病突变。DMRT1内含子2中14 kb纯合缺失可能是该研究中两姐妹的候选致病突变。采用不同序贯的遗传学方法逐步分析46,XY CGD患者的遗传病因,有助于全面了解46,XY CGD患者的分子病因。

MAP3K1基因rs16886165位点多态性与乳腺癌分子亚型遗传易感性的关系

目的作为一种高度异质性的恶性肿瘤，乳腺癌不同分子亚型临床特征、形态学表现和复发转移机制各异，但尚无MAP3K1基因多态性与乳腺癌亚型遗传易感性的研究报道。本研究拟深入探讨MAP3K1基因rs16886165位点T—G多态性与中国南方汉族女性散发性乳腺癌及其4种分子亚型易感性的关系。方法应用MassARRAY-IPLEX单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型技术对2009—0420—2014—07—20来自南方医科大学南方医院（149例）、广州军区总医院（190例）、南昌大学第一附属医院（100倒）、重庆市肿瘤医院（170例）的609例南方汉族女性乳腺癌患者和635名（南方医科大学南方医院333名，广州军区总医院55名，南昌大学第一附属医院90名，重庆市肿瘤医院157名）同期健康女性MAP3K1基因rs16886165位点进行基因分型；sNPStats在线分析软件比较两组在等位基因和基因型分布频率上的差异，非条件Logistic回归评价多态性位点与乳腺癌易感性的相关性；根据雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的免疫组化结果，将病例分为Luminal A、Luminal B、HER2富集型和三阴型，并进行分层分析。结果Recessive模型（与T／T＋T／G相比）结果提示，MAP3K1基因rs16886165位点G／G基因型与乳腺癌的易感性升高存在统计学关联（OR-1．45，95％CI：1．01～2．08）；但分层分析结果显示，rs16886165位点多态性仅与Luminal B型乳腺癌的易感性存在统计学关联，无论是Co—dominant模型中与T／T基因型相比（ORG／G-2．10，95％CI：1．18～3．73），还是Recessive模型中与T／T＋T／G相比（0R6／G-1．98，95％CI：1．14～3．46），携带G／G基因型患者发生Luminal—B型乳腺癌的风险均显著增加。结论MAP3K1基因rs16886165位点纯合基因型（G／G）与南方汉族女性散发性乳腺癌中的Luminal—B亚型易感性相关。

Map3k1调控小鼠眼睑闭合的研究进展

小鼠(Mus musculus)眼睑发育需要协调细胞增殖、细胞形态改变、迁移及凋亡。Map3k1是MAPK家族中重要的一员,Map3k1表达的蛋白质MEKK1是MAPK信号通路重要的节点。MEKK1-JNK信号通路活化c-jun,增强AP-1转录因子的转录活性,从而调控肌动蛋白纤维的形成和细胞的迁移。MEKK1还有可能通过c-jun与HB-EGF/EGFR-ERK信号通路相互作用。Map3k1基因敲除后,小鼠胚胎眼睑不能闭合,造成小鼠出生时眼睑开放,导致角膜病。因此,深入研究Map3k1基因功能将有可能为研究人类先天性眼睑缺陷及角膜病提供新的思路,为此类疾病的早期诊断、预防、治疗提供新的手段和途径。