人MAPK3基因克隆及其在肝细胞癌细胞中的作用

目的克隆人MAPK3基因,探讨MAPK3基因对肝细胞癌细胞的作用。方法以肝细胞总RNA为模板,利用RT-PCR体外扩增获得人MAPK3基因的蛋白编码区,并构建重组真核表达载体pEYFP-MAPK3;脂质体转染和G418药物筛选获得MAPK3稳转肝癌细胞株;蛋白免疫印迹检测稳转肝癌细胞株中外源MAPK3蛋白的表达量;实时无标记细胞分析技术检测MAPK3基因对肝癌细胞增殖的影响;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别MAPK3基因对肝癌细胞迁移和侵袭的影响;蛋白免疫印迹检测ERK信号通路靶基因及上皮-间质细胞转化标志物的表达变化。结果RT-PCR克隆获得人MAPK3基因,成功构建重组真核表达载体pEYFP-MAPK3并获得MAPK3基因稳转肝癌细胞株,发现MAPK3基因可以促进人肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,通过磷酸化活化Stat3,促进c-Myc、MMP-2和N-Cadherin表达升高和抑制E-Cadherin表达。结论成功克隆人MAPK3基因并证明MAPK3可以有效促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

KRAS基因沉默介导MAPK1/MAPK3信号通路对乳头状甲状腺癌上皮间质转化的分子机制研究

目的研究Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)基因沉默介导MAPK1/MAPK3信号通路对乳头状甲状腺癌细胞上皮间质转化的调控机制。方法收集80例乳头状甲状腺癌组织及相应癌旁组织,免疫组化法分析KRAS蛋白阳性表达率;购买人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1,分为空白组、阴性对照组、siRNA-KRAS组、SCH772984组、茴香霉素(Anisomycin)组、siRNA-KRAS+Anisomycin组,采用qRT-PCR和Western blotting法检测癌组织、癌旁组织和各组细胞中KRAS、C-jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK1)、细胞外信号调节蛋白激酶2(ERK2)、p-JNK、p-ERK1、p-ERK2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)及E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)的mRNA和蛋白表达水平。采用光学显微镜观察各组细胞上皮间质转化状态。结果癌组织的KRAS阳性表达率高于癌旁组织(63.75%vs.36.25%);与癌旁组织比较,癌组织中E-cadherin表达下调,KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1表达上调(均P<0.05)。在细胞实验中,沉默KRAS和抑制MAPK1/MAPK3信号通路能够抑制JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1的表达,激活E-cadherin的表达(均P<0.05),同时抑制上皮间质转化。激活MAPK1/MAPK3信号通路能够激活JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1的表达,抑制E-cadherin的表达(均P<0.05),同时激活上皮间质转化。而沉默KRAS表达并Anisomycin处理,可逆转沉默造成的上述功能改变,与空白组和阴性对照组无明显差异。结论KRAS基因在乳头状甲状腺癌中高表达,沉默KRAS基因能抑制MAPK1/MAPK3信号通路,从而抑制乳头状甲状腺癌的上皮间质转化。

雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白表达的影响

[目的]利用雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞进行刺激,检测与分析绵羊输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白表达的变化。[方法]以5代内的绵羊输卵管上皮细胞作为研究对象,通过qPCR及Western blot检测添加10-8 mol/L的雌二醇(以等量培养基替代雌二醇作为对照组)作用0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h后输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白的表达情况。[结果]在绵羊输卵管上皮细胞中添加10-8 mol/L雌二醇后,随着作用时间的延长,pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白的表达量整体呈先升高、后降低趋势。与作用0 h相比,pik3r3基因的mRNA表达量(P<0.01)及蛋白表达量(P<0.05)在雌二醇作用1.5 h时达到最高峰,Akt、mapk3基因的mRNA表达量(P<0.01)及蛋白表达量(P<0.05)在雌二醇作用2.5 h时达到最高峰。雌二醇作用3.0 h时,pik3r3、Akt、mapk3基因的mRNA表达量相比0 h都显著(P<0.05)提高。[结论]输卵管上皮细胞中pik3r3、Akt、mapk3基因的表达受到雌二醇调控。高浓度雌激素促进pik3r3、Akt、mapk3基因的高表达,这可能与生殖道的天然防御有关,并可能通过该途径提高机体自身免疫应答能力。

三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的克隆及表达分析

植物MAPK信号途径在植物生长发育以及多种逆境胁迫响应和激素调控过程中发挥着至关重要的作用。本文利用RACE-PCR技术克隆三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。克隆所得的Aktmapk3基因的ORF全长序列为1 164 bp,编码387个氨基酸,其编码的蛋白具有ATP结合位点,MAPK激酶保守结构和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活位点,推测其可能通过被磷酸化而激活以及通过磷酸化下游蛋白而执行生理功能。实时荧光定量PCR结果显示,Aktmapk3基因在三叶木通各组织器官均有表达,在芽成熟叶片以及花中表达量比较高,在茎、幼叶和果肉中的表达量最低,暗示该基因可能参与了三叶木通芽的形成和花的发育。

人MAPK3基因原核表达载体的构建及鉴定

目的探讨人丝裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)基因原核表达载体的构建及鉴定。方法取对数生长期正常人肝细胞系HL-7702细胞,采用TRIzol法抽提细胞总RNA,以此为模板用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)反转录扩增MAPK3基因的蛋白编码区,脱氧核糖核苷酸(DNA)测序鉴定后插入原核表达载体pGEX-4t-1中构建重组原核表达质粒(命名为pGEX-MAPK3_(GST));将pGEX-MAPK3_(GST)导入细菌Rosetta(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用Sepharose 4B亲和层析法纯化MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用考马斯亮蓝染色和蛋白免疫印迹分析GST-MAPK3的蛋白纯度和验证目的蛋白。结果RT-PCR法成功克隆了人MAPK3基因的蛋白编码区,DNA测序结果显示该片段无任何突变;用克隆获得的基因片段成功构建了pGEX-MAPK3_(GST),通过原核表达的方式获得了GST-MAPK3,并通过亲和层析纯化了GST-MAPK3。结论成功克隆人MAPK3基因并获得MAPK3蛋白,可用于体外研究MAPK3对细胞角蛋白18(CK18)的磷酸化作用。

过表达SlMAPK3提高番茄植株田间抗旱性

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联是植物中重要的信号传递通路,参与调控植株的多种生物和非生物胁迫。为研究SlMAPK3对番茄耐旱方面的影响,本试验以野生型番茄M82及其过表达SlMAPK3株系OE1、OE3、OE4为研究对象,定植田间后,6~7片真叶期进行中度干旱处理保持田间持水量45%~55%,于开花期,统计植株的高度、结果量,比较了不同株系之间果实大小、果实产量以及植株叶片抗氧化活性差异。在田间条件研究中发现,SlMAPK3过表达番茄株系的耐性更强,暗示SlMAPK3在番茄抗旱中发挥重要调控作用,为番茄抗逆育种奠定基础。

β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析

背景:目前针对增生性瘢痕有效的预防和治疗措施仍然有限。而大多数植物中草药不良反应小且来源丰富,为预防和治疗增生性瘢痕提供了新的思路和方法。目的:通过网络药理学和分子对接技术探讨植物来源β-谷甾醇作用于增生性瘢痕成纤维细胞的潜在分子机制,并通过细胞学实验进行初步验证。方法:通过网络药理学方法,利用相关数据库及软件筛选β-谷甾醇的药物靶点,获取增生性瘢痕相关疾病靶点,取交集得到β-谷甾醇作用于增生性瘢痕的潜在作用(交集)靶点,使用Cytoscape软件和STRING数据库构建“药物-靶点-疾病”网络和蛋白质互作网络(PPI),同时筛选出PPI中核心作用靶点。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO生物学功能和KEGG通路富集分析,结合文献分析进一步确立与交集靶点关系密切的信号通路及核心靶点基因,应用AutoDock软件对β-谷甾醇和核心靶点蛋白进行分子对接。采用体外细胞实验验证β-谷甾醇对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和核心靶点基因mRNA表达的影响。结果与结论:①β-谷甾醇和增生性瘢痕的交集靶点共56个,PPI网络中筛选出10个核心靶点:酪氨酸激酶(SRC)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、载脂蛋白E(APOE)、雌激素受体1(ESR1)、固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、C-反应蛋白(CRP)、细胞间黏附分子1(ICAM1)和过氧化氢酶(CAT)。②结合文献报道和KEGG通路、GO功能分析结果,进一步认定MAPK信号通路与交集靶点关系密切,确定MAPK3(即为ERK1-MAPK)、CASP3、P53和肿瘤坏死因子为其核心靶点。③分子对接结果提示β-谷甾醇与核心靶点蛋白结合良好。④细胞实验结果表明,100μmol/L的β-谷甾醇能抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,降低线粒体膜电位、诱导细胞凋亡(P<0.01),使G1期细胞占比增加,S期细胞占比减少(P<0.05),同时上调CASP3、P53和肿瘤坏死因子mRNA表达(P<0.05),并下调MAPK3 mRNA表达(P<0.001)。⑤上述数据证实,β-谷甾醇可能通过激活肿瘤坏死因子通路,上调CASP3和P53的表达,诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡,同时抑制ERK-MAPK通路使细胞周期阻滞从而降低增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性。

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。

基于网络药理学和分子对接技术探讨三草保肝汤抗肝癌作用机制

利用网络药理学和分子对接技术,研究三草保肝汤(SancaoBaogan decoction,SBD)治疗肝癌的物质基础及其可能的作用机制.利用TCMSP数据库获取SBD的药材成分信息;利用TCMSP、Swiss target prediction、GeneCards、OMIM数据库得到药物和肝癌靶点;R语言统计得到SBD和肝癌靶点的交集,交集导入STRING平台绘制PPI网络,筛选核心靶点;利用Cytoscape构建“三草保肝汤⁃活性成分⁃潜在靶点”和“关键靶点⁃活性成分”互作网络,筛选主要成分;利用Metascape数据库对共有靶点进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;分子对接验证活性成分与靶点.Wersternblot实验验证三草保肝汤作用肝癌细胞的核心靶点.结果发现,SBD 4种主要活性成分为木犀草素、鞣花酸、山奈酚和槲皮素;SBD可通过多成分、多靶点、多通路发挥抗肝癌作用,其中,AKT1、MAPK3是抑制肝癌的重要靶点.

基于网络药理学联合分子对接探析健脾化浊消脂方防治代谢相关脂肪性肝病的作用机制

目的运用网络药理学及分子对接技术探究健脾化浊消脂方防治代谢相关脂肪性肝病作用机制。方法通过对TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM、TCM-MESH数据库的检索获取活性成分并预测靶点。检索GeneCards、OMIM、TTD及Disgenet数据库获取代谢相关脂肪性肝病靶点。将药物与疾病靶点取交集,运用可视化软件Cytoscape3.7.1构建核心成分-交集靶点网络,筛选活性成分和关键基因进行分子对接。通过Cytoscape将两者交集靶点导入David数据库进行基因本体(GO)富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路分析。结果经过筛选去重后获得健脾化浊消脂方成分靶点1761个,代谢相关脂肪性肝病靶点1058个,交集靶点122个。筛选出排名靠前的五种活性成分分别是:豆甾醇、β-谷甾醇、乙酸亚油醇酯、茯苓甾醇、穿贝海绵甾醇,关键基因分别是MAPK3、HSP90AA1、STAT3、EGFR、AKT1。分子对接结果显示五种活性成分与度值最高的MAPK3结合能力相对较好。GO富集分析显示这些靶点参与类固醇激素介导的信号通路、凋亡过程的负调控以及血管生成等生物学过程。KEGG通路分析显示这些靶点参与了HIF-1通路、胰岛素抵抗、2型糖尿病、mTOR通路及VEGF通路。结论健脾化浊消脂方防治代谢相关脂肪性肝病具有多靶点、多通路的潜在作用机制,可能是通过对MAPK3/HIF1α调控产生作用。

核心岩藻糖基化修饰调控NLRP3介导骨癌性疼痛的作用机制

目的研究核心岩藻糖基化(core fucosylation,CF)修饰对骨癌性疼痛的作用,并探究其作用机制。方法收集我院骨癌性疼痛患者30例,随机选取一半患者使用传统镇痛类药物吗啡治疗,设为吗啡组;另一半患者设为对照组。采用数字疼痛评分法(numerical rating scales,NRS)对所有患者进行疼痛评分;蛋白免疫印迹及ELISA实验观察患者血清及骨髓上清液中NLRP3、IL-1β、IL-18的表达情况;免疫沉淀观察NLRP3及CF修饰的变化。构建乳腺癌致骨癌性疼痛大鼠模型,将40只健康成年SD大鼠分为对照组、模型组、FUT8shRNA组、吗啡组。免疫荧光检测脊髓组织中CF修饰的变化特征;合成腺病毒包装的FUT8shRNA抑制大鼠体内CF修饰后检测脊髓组织中NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18的表达变化;利用VonFrey纤维丝测痛仪测量后爪对VonFrey纤维丝刺激的触觉异常性疼痛敏感性,通过缩爪机械阈值(PWT)和自由行走疼痛评分观察骨癌性疼痛对大鼠疼痛行为的影响,比较两种干预方法对NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt等蛋白表达变化的影响。结果与对照组相比,吗啡组疼痛强度明显降低、持续时间变短(P<0.05);吗啡组血清及骨髓上清液中NLRP3、IL-1β、IL-18表达明显下调(P<0.05);免疫沉淀实验结果显示,吗啡组NLRP3及CF修饰的水平明显下降(P<0.05)。在体内实验中,与对照组相比,模型组大鼠CF修饰表达明显升高(P<0.05);LCA、TNF-α、IL-1β、IL-18的水平显著上升(P<0.01);大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏明显加重(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt表达显著上调(P<0.05);与模型组相比,FUT8shRNA组和吗啡组大鼠CF修饰表达明显降低(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18的水平显著下降(P<0.01);大鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏明显缓解(P<0.05);NLRP3、TNF-α、IL-1β、IL-18、p38MAPK、PI3K、Akt表达显著下调(P<0.05)。结论抑制CF修饰可对骨癌性疼痛发挥保护作用,其作用机制可能与调控p38MAPK/PI3K/Akt/NLRP3信号通路有关。

厚朴酚调节MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路对动脉粥样硬化大鼠主动脉炎性损伤的影响

目的:探讨厚朴酚(Mag)对动脉粥样硬化(AS)大鼠主动脉炎性损伤及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚结构域样受体家族含吡啉结构域蛋白3(NLRP3)信号通路的影响。方法:从50只SD大鼠中随机选择10只作为对照组(NC组),其余构建AS模型后随机分为模型组(AS组)、Mag组(25 mg/kg)、阳性组(100 mg/kg地奥心血康)、Mag+通路激活剂组(Mag+1μg LPS组),每组10只。ELISA试剂盒检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,计算动脉硬化指数(AI);油红染色观察主动脉病理切片;流式细胞术检测外周血Th17/Treg细胞表达;RT-qPCR检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA、基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA表达情况;Western bloting检测MAPK/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达。结果:AS组主动脉较NC组出现斑块沉积、大量炎症细胞浸润等现象,TC、TG、LDL-C、Ox-LDL、AI指数、IL-6、IL-1β、TNF-α、Th17细胞水平、Th17/Treg比例、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平,以及NLRP3、p-MAPK/MAPK、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平显著增高(P<0.05),HDL-C、Treg细胞水平显著下降(P<0.05);与AS组比较,Mag组、阳性组主动脉损伤现象有所改善,TC、TG、LDL-C、Ox-LDL、AI指数、IL-6、IL-1β、TNF-α、Th17细胞水平、Th17/Treg比例、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平,以及NLRP3、p-MAPK/MAPK、p-NF-κB/NF-κB蛋白水平显著下降(P<0.05),HDL-C、Treg细胞水平显著升高(P<0.05)。而通路激活剂LPS可明显减弱Mag对AS大鼠主动脉炎性损伤的改善效果。结论:Mag可能通过抑制MAPK/NF-κB/NLRP3通路,缓解AS大鼠主动脉炎性损伤。

基于网络药理学和分子对接技术的丹皮酚治疗胃癌的作用机制预测及验证

目的利用网络药理学方法分析丹皮酚治疗胃癌的作用机制,并利用分子对接技术进行初步验证。方法利用TCMSP、SwissTargetPrediction和SymMap数据库分别获得化合物丹皮酚的已知作用靶点和预测作用靶点,利用GeneCards、CTD数据库获取胃癌的作用靶点,利用Venny 2.1.0将丹皮酚和胃癌作用靶点进行映射,得到共同靶点,利用SRTING获取靶点之间相互关系,Cytoscape 3.6.2绘制PPI网络,利用DAVID数据库进行富集分析,运用schrodinger软件包将丹皮酚和主要作用靶点进行分子对接验证并进行体外细胞实验研究验证。结果共获得124个丹皮酚治疗胃癌的作用靶点,87条信号通路和蛋白质磷酸化等16个生物学功能、质膜等5个细胞组分,蛋白质均聚活性等9个分子功能。分子对接示丹皮酚与靶点丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)结合能较强。体外细胞实验表明,丹皮酚能显著抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖,并使细胞中MAPK1、MAPK3、基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白表达水平显著下降,且呈现出对浓度与时间的依赖性,浓度越高、培养时间越久,抑制作用越强,蛋白表达水平下降越明显。结论丹皮酚可通过MAPK1、MAPK3、SRC、MMP9等靶点调控cancer中信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路通路实现对胃癌的干预作用。

参桃软肝方抑制人肝癌细胞HepG2活性的作用机制研究

目的探讨参桃软肝方抗肝癌的作用及机制。方法四甲基噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2活性及胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/丝裂原活化蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein Kinase B/mitogen-activated protein kinase,PI3K/Akt/MAPK)抑制剂:LY294002、Atk抑制剂(Akt inhibitor,Akti)、分裂原活化抑制剂(MEK inhibitor,MEKi)、c-Jun氨基末端蛋白激酶抑制剂(c-Jun N-terminal protein kainse inhibitor,JNKi)、凋亡抑制剂(Z-VAD)、自噬抑制剂(Wortmanin)、铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)、细胞坏死抑制剂(Necrostatin-1)对参桃软肝方抑制人肝癌细胞HepG2活性的影响;乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2的毒性作用;实时荧光定量(Real-time PCR)检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2焦亡标志物白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)的影响;蛋白质印迹法(Western blot)检测参桃软肝方对人肝癌细胞HepG2中Akt/ERK信号通路关键蛋白Akt、ERK、P-ERK蛋白表达的影响,凋亡信号通路关键蛋白半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase 3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl2)、Bcl2-Associated X的蛋白质(Bax),细胞焦亡标志物卵裂半胱天冬酶1(Cleavaged Caspase-1)蛋白表达的影响。结果参桃软肝方及醇提上清和沉淀都能有效抑制人肝癌细胞HepG2的活性(P<0.05),LY294002、Wortmanin、Akti、MEKi、JNKi、Z-VAD、Ferrostatin-1、Necrostatin-1对参桃软肝方、醇提上清和沉淀抑制人肝癌细胞HepG2活性没有显著的影响;参桃软肝方促进人肝癌细胞HepG2中LDH的释放,引起细胞毒性;参桃软肝方抑制人肝癌细胞HepG2焦亡标志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1的表达;参桃软肝方降低人肝癌细胞HepG2中Akt的蛋白表达,升高Caspase3蛋白表达量。结论参桃软肝方具有抑制肝癌细胞活性、抗肝癌的作用,其作用机制可能与自噬、坏死性凋亡等程序性死亡方式及PI3K/Akt/MAPK信号传导无关;能抑制Akt的表达和促进Caspase3表达有关。同时,能降低焦亡标志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1表达,很可能通过阻断细胞焦亡过程起作用。参桃软肝方抗肝癌活性优于总提物醇提上清和沉淀,醇提上清和沉淀很可能存在协同抗肝癌的作用。

连翘苷调节MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路对膝骨性关节炎大鼠软骨损伤的影响

目的探讨连翘苷调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对膝骨性关节炎大鼠软骨损伤的影响。方法采用经典碘乙酸钠(MIA)法制备膝骨关节炎大鼠模型,随机分为模型组、连翘苷组、C16-PAF(MAPK激活剂)组、连翘苷+C16-PAF组,每组10只,另选10只大鼠作为对照组,以连翘苷和C16-PAF分组处理后,检测大鼠关节肿胀度,并以步态评分和爪压评分评测大鼠关节功能;透射电镜检测各组大鼠关节软骨形态;TUNEL检测各组大鼠关节软骨细胞凋亡;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清促炎因子白细胞介素(IL)-18、IL-1β、前列腺素E2(PGE2)水平;免疫印迹检测大鼠关节软骨组织基质降解相关蛋白[基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9]、凋亡蛋白(caspase-3、Bax)和MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠关节软骨超微结构受损,关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、NLRP3蛋白表达及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05)。与模型组相比,连翘苷组大鼠关节软骨超微结构受损减轻,关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、NLRP3蛋白表达及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P<0.05);C16-PAF组大鼠关节软骨超微结构受损加重,关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、NLRP3蛋白表达及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05)。与C16-PAF组相比,连翘苷+C16-PAF组大鼠关节软骨超微结构受损减轻,关节肿胀度、步态评分和爪压评分、软骨细胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、软骨组织caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、NLRP3蛋白表达及p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P<0.05)。结论连翘苷可通过下调MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路而抑制炎症反应,减轻膝骨关节炎大鼠软骨损伤与凋亡,缓解其关节肿胀症状,改善大鼠关节功能。

右美托咪定通过MAPK/STAT3通路对AD大鼠海马神经元凋亡的影响

目的探索右美托咪定(Dex)通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/信号转导和转录激活子3(STAT3)通路对β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42致大鼠海马神经元凋亡的影响。方法随机分为假手术组、Aβ1-42组、Dex低剂量(Dex-L)组、Dex高剂量(Dex-H)组、Dex-H+Anisomycin组、Dex-H+colivelin组,给予不同给药处理后进行实验观察。结果Aβ1-42组大鼠海马组织神经元结构疏松,胞体形态异常,Aβ沉积严重,逃避潜伏期、炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平、细胞凋亡数目、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-STAT3/STAT3、cleaved caspase-3表达较假手术组均显著增加,穿越原平台次数、Bcl-2表达显著下降(P<0.05);经不同剂量Dex干预后均可逆转上述指标(P<0.05);MAPK通路激活剂及STAT3激活剂可减轻Dex对AD大鼠的保护作用(P<0.05)。结论Dex可以通过减少炎性因子水平以及Aβ沉积,降低细胞损伤和凋亡,保护大鼠海马神经元,可能与抑制MAPK/STAT3通路有关。

高氧诱导miRNA差异性表达介导新生大鼠的肺损伤

背景:支气管肺发育不良主要的病理特征是肺发育停滞和较轻微的组织结构损伤,胎儿肺发育需经历5个时期,到囊状期的胎儿生后才可能存活,因此,早产、高氧诱导支气管肺发育不良的发病机制研究重点关注了囊状期和肺泡期。目的:探讨2个发育阶段——囊状期和肺泡期中起调控作用的差异miRNA在高氧相关的支气管肺发育不良中的作用。方法:将新生SD大鼠随机分为4组:0 d组(n=10)出生后即取肺组织;4,7,14 d组均设置2个亚组,高氧组(n=10)出生后进入持续高氧环境中(氧浓度85%-90%),分别于4,7,14 d后取肺组织,空气组(n=10)出生后进入空气环境中(吸入氧浓度21%),分别于4,7,14 d后取肺组织。采用miRNA-Seq技术获取肺组织miRNA并建库,Illumina平台测序,Deseq2(Version 1.10.1)、Venn图组间比较依次筛选DEmiRs,GO富集、PPI分析预测差异表达的miRNAs靶蛋白。结果与结论:①0 d组有633个miRNA,4,7,14 d组中的高氧亚组分别有609,614,584个miRNA,空气亚组分别有629,608,581个miRNA;②在出生0-4 d(囊状期)、4-7 d、4-14 d(肺泡期)时,高氧组分别获得130,3,114个差异表达的miRNAs,空气组分别获得106,0,111个差异表达的miRNAs,各时期两组均差异表达的miRNAs分别为91,0,79个;③在囊状期和肺泡期,高氧组新生鼠肺组织中miR-34a-5p、miR-21-5p显著表达,miR-34a-5p靶蛋白有198个,围绕PDGFRB/PDGFRA/NGFR;miR-21-5p靶蛋白302个,围绕MAPK1/STAT3;④结果显示,miR-34a-5p、miR-21-5p各自在囊状期和肺泡期受高氧诱导显著表达,分别调控靶蛋白PDGFRB/PDGFRA/NGFR、MAPK1/STAT3,介导阶段性肺发育过程的信号通路,参与支气管肺发育不良的发生发展。

硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及MAPK1/3和MMP-8表达的影响

目的探讨气体信号分子硫化氢(H2S)对糖尿病大鼠心肌纤维化及MAPK1/3和MMP-8蛋白表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为4组:正常对照组、糖尿病大鼠组(STZ组)、硫化氢干预糖尿病大鼠组(STZ+H2S组)和硫化氢干预正常大鼠组(H2S组)。用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(40 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型;对照组每天腹腔注射生理盐水;STZ+H2S组与H2S组每天腹腔注射硫氢化钠(H2S供体)溶液(100μmol/kg),8周后处死大鼠,HE染色观察心肌纤维病理形态学变化,Western blot法检测Collagen I、MAPK1/3和MMP-8蛋白的表达。结果与对照组相比,糖尿病组大鼠心肌组织胶原含量明显升高,心肌间质纤维化,Collagen I、MAPK1/3和MMP-8蛋白表达水平显著升高(P<0.05);糖尿病大鼠经硫化氢干预后大部分心肌纤维呈平行排列,结构清晰,间质有少量疏松结缔组织,Collagen I、MAPK1/3和MMP-8蛋白表达水平明显下调(P<0.05),而非糖尿病硫化氢干预组心肌纤维化程度及心肌组织Collagen I、MAPK1/3和MMP-8蛋白表达水平较对照组均无明显差异(P>0.05)。结论 H2S可改善糖尿病大鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制MAPK1/3/MMP-8信号通路有关。

LCMT1在肝癌中的表达和预后的意义

目的:探讨亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)在肝癌中的表达和预后的意义。方法:通过收集网络数据库GEPIA中有关信息进行LCMT1表达情况的分析、相关性分析和生存分析,然后通过免疫组化染色进一步分析LCMT1在肝癌中的表达和预后。结果:LCMT1在肾上腺皮质癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌和胸腺瘤中的表达和正常组织的表达相比具有统计学意义(P<0.05)。LCMT1在肝癌中高表达,且高表达的患者生存时间短,更容易发生转移。LCMT1和金属蛋白酶2(MMP2)之间的相关系数为0.324(P<0.05)。LCMT1和丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)存在正相关关系且相关系数为0.76(P<0.05)。结论:LCMT1在肝癌中高表达,且高表达与患者的不良预后有关,LCMT1可能通过激活MAPK3的磷酸化而促进肝癌的发生。

人EGFR显性负性突变体对胃癌细胞在裸鼠体内成瘤性及淋巴结转移的影响

为了研究人表皮生长因子显性负性突变体(dominant negative mutant of EGFR,dnEGFR)对胃癌细胞体内成瘤及淋巴结转移的影响,用目的质粒pEGFPN1-dnEGFR,空质粒载体pEGFP-N1分别转染胃癌细胞NCI-N87.筛选出稳定转染株,实验共分3组:NCI-N87细胞未转染组(untreated NCI-N87,UN组),NCI-N87细胞pEGFP-N1转染组(EN组);NCI-N87细胞pEGFPN1-dnEGFR转染组(DN组).将3组细胞接种于裸鼠右后足垫,6周后测量移植瘤大小及对应腹股沟转移淋巴结数目,HE染色验证,real-time PCR和Western印迹检测3组细胞中AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白的表达改变.结果发现,DN组移植瘤较UN、EN组明显缩小(P<0.05),且右腹股沟转移淋巴结数目较UN、EN组减少(P<0.05).DN组细胞中,AKT1、MAPK3 mRNA和蛋白水平较UN、EN组降低(P<0.05).提示pEGFPN1-dnEGFR可抑制裸鼠体内胃癌细胞成瘤及淋巴结转移,AKT1及MAPK3信号通路可能参与其中.