重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用

目的 :研究重组人MUC1 MBP的抗肿瘤作用。方法 :用重组人MUC1 MBP皮下注射途径免疫健康鼠 ,采用MTT法测定小鼠抗MUC1特异的CTL活性 ;通过免疫鼠成瘤及荷瘤鼠治疗实验检测其对肿瘤的预防和治疗作用。结果 :MUC1 MBP免疫鼠CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 (47.7± 4 .3) %和 (6 7.5± 6 .5 ) % ;免疫鼠成瘤结果免疫组小鼠共长 5个肿瘤 ,存活时间明显延长 ,对照组共长 5 1个 ,平均生存时间 2 3d ;荷瘤鼠治疗结果显示治疗组小鼠肿瘤平均体积 386mm3 ,对照组小鼠肿瘤平均体积 4 0 0 0mm3 。结论 :重组人MUC1 MBP具有明显的治疗、预防肿瘤和抑制肿瘤转移的作用 ,有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。

MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建

肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。

基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定

目的：制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性。方法：将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IPTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Muc1的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP。将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌。结果：获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白。Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为（74.5±5.9）%和（60.5±10.4）%,与对照组比P〈0.05,差异显著;Muc1-MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞。结论：成功制备重组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠Lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用。

重组人MUC1-MBP融合蛋白诱导小鼠Th1活化

目的检测重组MUC1-MBP融合蛋白对小鼠Th1细胞的活化作用。方法通过生物活性法测定MUC1-MBP免疫鼠脾细胞培养上清液中IL-2I、FN和血清中TNF水平;通过免疫组织化学染色法检测CD4+T细胞在肿瘤组织中的浸润。结果MUC1-MBP免疫鼠脾细胞分泌IL-2和IFN及血清TNF水平较对照组明显增高;MUC1-MBP诱导小鼠CD4+T细胞在肿瘤组织中浸润。结论重组人MUC1-MBP融合蛋白可激活小鼠Th1细胞。

超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价

目的:评价超滤技术去除纯化后重组MUC1-MBP融合蛋白(MUC1-MBP)溶液中内毒素的效果,阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法:选取表达MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌,分别通过CM Sepharose FF离子交换层析(CM)(CM组)、CM联合Phenyl Sepharose 6FF疏水层析(C6)(CM+C6组)、CM加超滤(CM+超滤组)以及CM联合C6加超滤(CM+C6组+超滤)进行纯化,并去除内毒素;采用SDS-PAGE分析蛋白纯度;鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果:SDS-PAGE分析,在预期相对分子质量62 000处呈现单一条带,Quantity One分析纯度>96%;CM组与CM+C6组内毒素表达水平均较高,但2组比较差异无统计学意义(P>0.05);与CM组比较,CM+超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);与CM+C6组比较,CM+C6超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);CM+超滤组与CM+C6+超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CM或CM联合C6均不能有效去除内毒素,其中C6对去除内毒素几乎无作用;CM加超滤可有效去除内毒素,超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。

MBP-CsgAⅢ融合蛋白的表达和纯化

目的构建CsgA亚单位蛋白的原核表达系统,获得纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定基础。方法用PCR的方法从大肠杆菌野生株MC4100株中扩增出csgA基因,连接到pMALp2质粒上,构建pZBaⅢ重组质粒。将重组质粒转入XL1Blue菌中用IPTG诱导表达,用AmyloseResin纯化系统纯化。结果成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,获得大量纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白。结论成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,应用该系统能有效表达MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定了基础。

表达人 HGF/MBP 融合蛋白的 pMAL-MBP/HGF 重组质粒的构建及鉴定

将人ＨＧＦ完整编码区ｃＤＮＡ片段插入ＭＢＰ表达型ｐＭＡＬ－Ｃ２载体质粒中，构建了表达人ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白的ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＨＧＦ重组质粒。表达的ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析分子量约为１１０ｋＤ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ表明能被兔抗ＭＢＰ抗体和抗人ＨＧＦＭｃＡｂ所识别。结果提示可利用该表达型重组质粒制备重组人ＨＧＦ。

重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3)(pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。

重组鼠Muc1-MBP融合蛋白疫苗体内抗肿瘤作用

目的:研究重组鼠Muc1-MBP蛋白的体内抗肿瘤作用.方法:采用皮下注射法将不同剂量Muc1-MBP蛋白免疫小鼠,2wk/次,共免疫3次.在第3次免疫后4d,给予C57BL/6小鼠尾静脉注射LLC1细胞,或给予5GyX射线照射的ICR小鼠背部皮下注射MCF-7细胞.注射3wk后剥离并测量肿瘤大小;肿瘤组织行常规HE染色.免疫组织化学染色分析肿瘤周围浸润的淋巴细胞亚群.结果:LLC1细胞尾静脉接种后21d,肺肿瘤结节对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠分别为54和39个(100%),Muc1-MBP0.3g/L组小鼠共计17个(60%),提示Muc1-MBP0.3g/L组可显著抑制肺癌的生长(P<0.05),Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.皮下接种MCF-7细胞后21d,对照组,Muc1-MBP0.15g/L组小鼠100%(6/6)可见乳腺癌瘤体形成,平均体积分别为(142.8±70.2)和(96.1±53.4)mm3,Muc1-MBP0.3g/L组瘤体形成66.7%(4/6),平均体积为(54.5±46.7)mm3.表明Muc1-MBP0.3g/L组免疫后可显著抑制人乳腺癌移植瘤生长(P<0.05),Muc1-MBP0.15g/L组作用较弱.免疫组化结果显示Muc1-MBP免疫组肿瘤周围有大量CD4+和CD8+T的细胞浸润到肿瘤周围.结论:Muc1-MBP诱导免疫能够明显抑制LLC1,MCF-7细胞的生长,为临床应用研究奠定了基础.

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。

人MUC1和鼠Muc1蛋白疫苗抗肿瘤作用的比较

目的:探讨重组人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP疫苗的抗肿瘤作用,为肿瘤疫苗的临床应用提供实验依据。方法:用人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP融合蛋白分别免疫小鼠,实验分为阴性对照组、人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组,ELISA方法分别检测小鼠血清抗人MUC1抗体与抗鼠Muc1抗体的交叉反应;LDH法检测小鼠抗人MUC1和鼠Muc1特异的CTL活性。通过小鼠肺癌转移模型及皮下人乳腺癌移植瘤模型检测人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫诱导的抗肿瘤作用。结果:抗人MUC1抗体和鼠Muc1抗原可产生较强的交叉反应,抗鼠Muc1抗体与人MUC1抗原可产生较弱的交叉反应;人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫均可诱导CTL杀伤活性,对MCF-7细胞杀伤活性分别为(48.7±7.1)%和(54.6±7.8)%,对LLC1细胞杀伤活性分别为(61.9±10.2)%和(43.5±8.4)%。人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组小鼠Lewis肺癌的肺结节转移抑制率分别为94.4%和68.5%;在人乳腺癌移植瘤实验中,人MUC1-MBP组、鼠Muc1-MBP组和PBS组小鼠肿瘤平均体积分别(23.5±15.7)、(56.5±46.7)和(142.8±70.2)mm3,人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论:人MUC1和鼠Muc1有共同的B和T细胞表位,人MUC1诱导的交叉反应更强烈;人MUC1-MBP诱导的抗肿瘤活性强于鼠Muc1-MBP抗肿瘤活性;人MUC1-MBP有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。

肉毒毒素蛋白受体sytIIN端片段基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达

旨在构建肉毒毒素蛋白受体sytIIN端片段的原核表达载体,并在大肠杆菌pMAL-c2x系统中表达MBP-Syt融合蛋白。根据GenBank中已报道的人sytII基因序列,截取N端氨基酸序列,依据大肠杆菌的偏爱密码子,设计引物人工合成全基因,将全长基因克隆至原核表达载体pMAL-c2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli ER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Amylose Resin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和免疫印记对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析,为进一步研究毒素与受体相互作用的机制奠定基础。

以融合蛋白形式在E·Coli中表达人神经生长因子

将人神经生长因子基因（hNGF）克隆到pMalC2质粒中，构建了表达产物为麦芽糖结合蛋白（MBP）与hNGF的融合蛋白重组质粒。经由内切酶再水解及DNA序列测定等分析表明，重组质粒含hNGF基因（360bP），该质粒在E·Coli中的表达产物为融合蛋白MBP－hNGF（55kd），光密度扫描表明，其表达量约为30％。

拟南芥组蛋白甲基化酶SUVH6中SRA结构域基因的克隆及表达

[目的]研究甲基化修饰对遗传基因调节的作用。[方法]利用拟南芥RNA反转录得到的cDNA序列为模板,克隆出SUVH6-SRA基因,并成功构建了含有SUVH6-SRA基因的表达载体pMAL-c2P-SUVH6-SRA,然后将pMAL-c2P-SUVH6-SRA质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达带有MBP标签的SUVH6-SRA融和蛋白。[结果]pMAL-c2P-SUVH6-SRA克隆在转化到大肠杆菌BL21(DE3)后,在37℃条件下,经过终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导,大肠杆菌BL21(DE3)能够获得大量可溶性MBP-SUVH6-SRA融和蛋白并顺利表达,SDS-PAGE显示诱导表达的融和蛋白相对分子质量为66.0 kDa左右,与预测的结果相吻合。[结论]在MBP与目的蛋白之间引入了PPE酶切位点,可使MBP和SUVH6蛋白分离,并在使用MBP亲和层析和PPE酶切后,获得了纯度较高的SUVH6蛋白,表明成功构建了SUVH6-SRA-MBP融和蛋白原核表达系统。

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO(TvDAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时,目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右,比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍;但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时,DAAO酶活达到了3.24u/mL,比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。