重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用

目的 :研究重组人MUC1 MBP的抗肿瘤作用。方法 :用重组人MUC1 MBP皮下注射途径免疫健康鼠 ,采用MTT法测定小鼠抗MUC1特异的CTL活性 ;通过免疫鼠成瘤及荷瘤鼠治疗实验检测其对肿瘤的预防和治疗作用。结果 :MUC1 MBP免疫鼠CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 (47.7± 4 .3) %和 (6 7.5± 6 .5 ) % ;免疫鼠成瘤结果免疫组小鼠共长 5个肿瘤 ,存活时间明显延长 ,对照组共长 5 1个 ,平均生存时间 2 3d ;荷瘤鼠治疗结果显示治疗组小鼠肿瘤平均体积 386mm3 ,对照组小鼠肿瘤平均体积 4 0 0 0mm3 。结论 :重组人MUC1 MBP具有明显的治疗、预防肿瘤和抑制肿瘤转移的作用 ,有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。

MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建

肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。

NGF对坐骨神经损伤后腰髓与损伤神经MBP含量变化的影响

目的 探讨大鼠周围神经损伤后相应神经与脊髓组织髓鞘碱性蛋白 (Myelinbasicprotein ,MBP)含量变化及神经生长因子 (NGF)的影响。方法 Wistar大鼠行单侧坐骨神经切断 ,断端采用硅胶管桥接 ,管内注入NGF ,应用酶联免疫吸附法测定腰段脊髓和损伤坐骨神经组织MBP含量的变化 ,实验分为Ⅰ组 :生理盐水对照 ;Ⅱ组 :硅胶管内给NGF ;Ⅲ组 :硅胶管内给NGF +每日肌肉注射NGF(5 0 0ng/kg连续 2周 )。结果 治疗组之间比较无统计学意义 ;治疗组与对照组相比较有非常显著性差异 (P <0 0 1) ;治疗组2 4h、2周时MBP含量较伤前显著升高 (P <0 0 1) ,4周恢复到伤前水平。结论 NGF治疗能减少MBP含量 。

重组人MUC1-MBP融合蛋白诱导小鼠Th1活化

目的检测重组MUC1-MBP融合蛋白对小鼠Th1细胞的活化作用。方法通过生物活性法测定MUC1-MBP免疫鼠脾细胞培养上清液中IL-2I、FN和血清中TNF水平;通过免疫组织化学染色法检测CD4+T细胞在肿瘤组织中的浸润。结果MUC1-MBP免疫鼠脾细胞分泌IL-2和IFN及血清TNF水平较对照组明显增高;MUC1-MBP诱导小鼠CD4+T细胞在肿瘤组织中浸润。结论重组人MUC1-MBP融合蛋白可激活小鼠Th1细胞。

MBP-52位点多态性与肺结核易感性的病例对照研究

[目的]探讨甘露糖结合蛋白(MBP)基因多态性与汉族人群肺结核发病的关系。[方法]采用病例对照研究,用特异引物PCR方法进行MBP的基因分型,对肺结核发病影响因素进行问卷调查,并进行单因素分析和多因素非条件Logistic回归分析。[结果]对126例病例和202例对照的MBP基因52位点进行分型,野生型、突变型(杂合子+纯合子)两种基因型在病例组和对照组中的分布频率分别为男性86.7%、13.3%、95.7%和4.3%;女性93.0%、7.0%、85.9%和14.1%。男性病例的突变频率显著高于对照组(OR为6.222,OR95%CI为1.285～30.134),而女性病例的突变频率明显低于对照组(OR为0.646,OR95%CI为0.564～0.740)。在多因素分析中调整卡介苗接种史、卡痕和家族史后,MBP-52基因突变与肺结核发病仍有统计学意义,与单因素分析的结果相同。[结论]MBP-52位点C/T突变可能与肺结核发病相关。

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。

基因工程鼠Muc1-MBP融合蛋白的制备及其免疫活性测定

目的：制备鼠Muc1-MBP融合蛋白,探讨其免疫活性。方法：将pMAL-Muc1转化大肠杆菌,通过IPTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定Muc1的表达,Amylose resin亲和层析纯化Muc1-MBP。将Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清Muc1特异性抗体的水平;MTT法测定小鼠抗Muc1特异的CTL活性;ELISPOT法测定脾脏淋巴细胞IFN-γ的分泌。结果：获得稳定表达Muc1的菌株,制备了分子量67 kD较纯的Muc1-MBP融合蛋白。Muc1-MBP融合蛋白免疫小鼠产生高效价Muc1特异抗体,效价在8 000~16 000之间,Muc1-MBP融合蛋白可诱导CTL杀伤活性,对人乳腺癌MCF-7和小鼠Lewis肺癌LLC1靶细胞的杀伤率分别为（74.5±5.9）%和（60.5±10.4）%,与对照组比P〈0.05,差异显著;Muc1-MBP融合蛋白免疫可诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,特异性活化Th1细胞。结论：成功制备重组鼠Muc1-MBP融合蛋白,其不仅能诱导特异体液免疫应答,而且可诱导细胞免疫应答,尤其能诱导对人类MCF-7细胞较小鼠Lewis肺癌LLC1细胞更加强烈的CTL杀伤活性,提示异种同源蛋白疫苗具有比同源蛋白疫苗更好的抗肿瘤作用。

重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3)(pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。

体外培养条件下钾离子对少突胶质细胞表达MBP的影响

应用体外培养、免疫细胞化学和计算机辅助图象分析方法研究了少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白及高钾离子（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）对少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白的影响。结果表明，体外培养条件下，少突胶质细胞最早表达髓鞘碱性蛋白是在培养第７天。髓鞘碱性蛋白阳性的少突胶质细胞可分为大、中、小和双核四种类型，它们的构成比随培养时间延长呈动态变化。高Ｋ＋不影响少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白。实验结果提示，体外培养条件下，少突胶质细胞仍能正常表达髓鞘碱性蛋白，且表达时程并不依赖神经元的存在；细胞外Ｋ＋浓度升高对髓鞘碱性蛋白在少突胶质细胞内的正常合成及表达过程无明显影响。本文对少突胶质细胞表达髓鞘碱性蛋白后的体积变化与其与中枢神经系统髓鞘形成的关系进行了讨论。

超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价

目的:评价超滤技术去除纯化后重组MUC1-MBP融合蛋白(MUC1-MBP)溶液中内毒素的效果,阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法:选取表达MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌,分别通过CM Sepharose FF离子交换层析(CM)(CM组)、CM联合Phenyl Sepharose 6FF疏水层析(C6)(CM+C6组)、CM加超滤(CM+超滤组)以及CM联合C6加超滤(CM+C6组+超滤)进行纯化,并去除内毒素;采用SDS-PAGE分析蛋白纯度;鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果:SDS-PAGE分析,在预期相对分子质量62 000处呈现单一条带,Quantity One分析纯度>96%;CM组与CM+C6组内毒素表达水平均较高,但2组比较差异无统计学意义(P>0.05);与CM组比较,CM+超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);与CM+C6组比较,CM+C6超滤组内毒素表达水平明显降低(P<0.01);CM+超滤组与CM+C6+超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CM或CM联合C6均不能有效去除内毒素,其中C6对去除内毒素几乎无作用;CM加超滤可有效去除内毒素,超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。

重组大肠杆菌生产可溶性MBP融合肝素酶的培养条件优化

为确立肝素酶Ⅰ的高效生产工艺,利用麦芽糖结合蛋白(MBP)与肝素酶Ⅰ融合性能,通过构建相应的表达质粒pMHS,在大肠杆菌方面实现了肝素酶Ⅰ可溶性表达。通过对LB培养基摇瓶培养E.coliTB1(pMHS)的诱导时机、诱导剂用量以及添加葡萄糖、酵母提取物、乙醇、氯霉素和卡那霉素等一系列培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶融合蛋白MBP-hepA的最佳生产条件。

MBP-CsgAⅢ融合蛋白的表达和纯化

目的构建CsgA亚单位蛋白的原核表达系统,获得纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定基础。方法用PCR的方法从大肠杆菌野生株MC4100株中扩增出csgA基因,连接到pMALp2质粒上,构建pZBaⅢ重组质粒。将重组质粒转入XL1Blue菌中用IPTG诱导表达,用AmyloseResin纯化系统纯化。结果成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,获得大量纯化的MBPCsgAⅢ融合蛋白。结论成功构建了MBPCsgAⅢ融合蛋白的原核表达系统,应用该系统能有效表达MBPCsgAⅢ融合蛋白,为进一步研究CsgA的生物学特性和致病机理奠定了基础。

氟中毒大鼠脑组织MBP、NSE、氟含量及CHE活性分析

目的 探讨氟中毒对脑髓鞘、神经元、神经递质的损伤 ,研究氟中毒对脑功能的损伤机理。方法 采用动物实验 ,用含氟 (F- ) 15 0 mg/ L 的水饲养 Wistar大鼠 7个月 ,断头取脑 ,用 4℃生理盐水迅速制成 1∶ 5匀浆液 ,离心取上清液。用酶联免疫吸附测定法 (EL ISA)检测髓鞘碱性蛋白 (MBP)和神经元特异性烯醇化酶 (NSE)含量 ;用自动生化分析仪检测胆碱脂酶 (CHE)活性 ,用氟离子选择电极法检测 F-含量。结果 氟中毒大鼠脑组织匀浆上清液 MBP、NSE含量显著低于对照组 ,CHE活性和 F- 含量显著高于对照组。结论 氟可直接损伤脑神经髓鞘、神经元和中枢神经递质。这一系列变化均可能影响脑功能。

S-100B,NSE和MBP评估重型颅脑损伤预后的研究

目的研究重型颅脑损伤后血清S-100B蛋白、神经特异性烯醇化酶(NSE)和碱性髓鞘蛋白(MBP)浓度在预后评估中的价值。方法对2002年1月至2002年12月40例重型颅脑损伤住院病人在伤后12h内进行血清S-100B、NSE和MBP浓度检测,并结合GOS评分进行比较分析。结果本组40例重型颅脑损伤病人伤后血清S-100B、NSE和MBP浓度均显著高于正常对照组,不同预后组之间S-100B、NSE和MBP浓度存在显著差异。分别以伤后12h血清S-100B浓度2.0μg/L、NSE浓度30ng/ml和MBP浓度10ng/ml为分界标准评估预后,S-100B评估预后的特异度为91%,敏感度72%;NSE特异度为77%,敏感度67%;MBP特异度为63%,敏感度61%。结论伤后血清S-100B蛋白、NSE和MBP浓度对评估重型颅脑损伤预后具有较高的特异性和敏感性。而S-100B浓度在预后评估中的作用较NSE和MBP更为敏感,特异,因此可作为评估重型颅脑损伤预后的一种可靠的临床指标。

妊娠合并糖尿病母亲新生儿脐血S100B蛋白、NSE、MBP水平及NBNA相关性研究

目的:探讨妊娠合并糖尿病母亲分娩的新生儿脐血血清中S100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enofase,NSE)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)水平分别与新生儿行为神经测定(Neonatal Behavioral Neurological Assessment,NBNA)评分的相关性。方法:2012年9月至2013年3月在上海交通大学附属第一人民医院产科常规产前检查及分娩的176例单胎孕妇及其分娩的新生儿。参照《2011年妊娠合并糖尿病诊治推荐指南》,将这些产妇分为:血糖正常孕妇组(n=59例)、糖尿病合并妊娠组(DM组,n=32例)、妊娠期糖尿病组(GDM组);同时根据GDM组患者是否应用胰岛素分为无胰岛素治疗组(GDM-A1组,n=44例)和胰岛素治疗组(GDM-A2组,n=41例)。其中DM组、GDM-A1组和GDM-A2组所分娩的新生儿为实验组。同期孕周相似、血糖正常孕妇所分娩的新生儿为对照组。采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定新生儿脐血S100B蛋白、MBP水平。采用电化学方式测定新生儿脐血NSE水平。同时生后3天对新生儿进行新生儿行为神经测定(NBNA)。结果:(1)对照组、GDM-A1组、GDM-A2组、DM组新生儿脐血血清S100B蛋白、NSE、MBP水平组间差异显著(F=13.067,F=14.428,F=8.772,P<0.05)。且与对照组比较,GDM-A1组、GDM-A2组、DM组新生儿脐血血清S100B蛋白、NSE水平上升明显,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,GDM-A2组新生儿脐血血清MBP水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)对照组、GDM-A1组、GDM-A2组、DM组NBNA评分水平组间差异显著(F=7.002,P<0.05)。且与对照组比较,GDM-A1组、GDM-A2组、DM组NBNA评分降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)妊娠合并糖尿病母亲所分娩的新生儿脐血血清S100B蛋白、NSE水平分别与NBNA评分呈负相关(r=-0.0159,r=-0.0177,P<0.05),新生儿脐血血清MBP水平与NBNA评分无相关性(r=-0.0992,P>0.05)。结论:脐血S100B蛋白、NSE、MBP这三种分子作为新生儿中枢神经系统常在的低表达蛋白,其表达水平升高,提示妊娠合并糖尿病母亲分娩的新生儿存在脑损伤。联合检测脐血S100B蛋白、NSE、MBP和NBNA对早期发现新生儿脑损伤有重要意义。

表达人 HGF/MBP 融合蛋白的 pMAL-MBP/HGF 重组质粒的构建及鉴定

将人ＨＧＦ完整编码区ｃＤＮＡ片段插入ＭＢＰ表达型ｐＭＡＬ－Ｃ２载体质粒中，构建了表达人ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白的ｐＭＡＬ－ＭＢＰ／ＨＧＦ重组质粒。表达的ＨＧＦ／ＭＢＰ融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析分子量约为１１０ｋＤ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ表明能被兔抗ＭＢＰ抗体和抗人ＨＧＦＭｃＡｂ所识别。结果提示可利用该表达型重组质粒制备重组人ＨＧＦ。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。

21.5kD MBP RNAi有效靶点的筛选及验证

目的:构建21.5 kD MBP基因干扰序列21.5 kD MBP-shRNA(21.5 kD MBP short hairpin RNA interference),筛选最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究提供实验材料。方法:将21.5 kD MBP-shRNA阳性真核表达载体和阴性真核表达载体经脂质体介导分别转入人神经胶质瘤细胞株U251中,观察转染24 h后的转染效率;提取各组细胞总RNA,用实时荧光定量PCR技术检测各组21.5 kD MBP基因在mRNA水平的表达差异性。结果:21.5kD MBP-shRNA真核表达重组载体被成功转染入U251细胞,与阴性对照质粒(pGenesil-1-MBP-neg)转染组相比,沉默质粒转染组(pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3质粒分别转染)细胞中21.5 kD MBP mRNA表过水平均显著下降(P<0.05),其中pGenesil-1-MBP-3转染组细胞中21.5 kD MBP mRNA表达水平最低。结论:成功筛选出最佳沉默效果的21.5 kD MBP-shRNA真核表达载体,为21.5 kD MBP基因功能研究及基因治疗研究奠定了实验基础。