美洲水貂(Neovison vison)黑素皮质激素受体-1(MC1R)基因序列鉴定及生物信息学分析

旨在探明美洲水貂黑素皮质激素受体-1(Melanocortin-1receptor,MC1R)基因序列结构特征及其对皮毛颜色的调控机制。根据欧洲水貂MC1R基因(GenBank登录号:AB189820)核苷酸序列设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定美洲短毛黑水貂MC1R基因完整编码区序列(CDS),并对该序列进行了BLAST比对及生物信息学预测和分析。结果表明,获得的美洲水貂MC1R基因与欧洲水貂相似性为95%,为单一外显子基因,核苷酸序列长度为1 324bp,包括部分5′UTR(188bp)、CDS(954bp)和3′UTR(182bp),编码区碱基G+C含量高达66.04%,由CDS推导共编码317个氨基酸,预测的MC1R蛋白理论分子质量为34.49ku,等电点(PI)为8.97,不稳定系数是36.63,属于弱碱性稳定蛋白质。进一步分析发现,美洲水貂MC1R基因编码的蛋白存在1个低复杂度结构域和7个典型的跨膜区,N-端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有典型的细胞膜受体结构。分子进化分析显示,美洲水貂与欧洲水貂亲缘关系较近,与二者均属鼬科、鼬属动物的传统动物分类学一致。美洲水貂MC1R基因的获取及序列结构特征分析为揭示其皮毛颜色多样性的分子遗传学机制奠定了详细的生物信息学基础。

饲料浮萍水平对大正三色锦鲤TYR及MC1R基因表达的影响

为探究饲料中不同浮萍添加水平对大正三色锦鲤酪氨酸酶TYR以及黑素皮质素受体MC1R基因表达的影响,配制浮萍添加水平分别为0%、3%、6%、9%、13%、14%6种等蛋白(38.6%)饲料饲养大正三色锦鲤(42.19±1.32)g 8周,分别记为Diet 1(0/13)、Diet 2(3/10)、Diet 3(6/7)、Diet 4(9/4)、Diet 5(13/1)、Diet 6(14/0)。每种饲料设3个重复,每个重复饲喂10尾鱼。试验结果表明:(1)TYR基因在大正三色锦鲤的心脏、肝脏、眼睛、黑色皮肤、脑中均有表达,并且在脑、皮肤、眼睛中表达量相对较高;(2)各组织中TYR mRNA表达量随浮萍添加水平的升高均有一定波动,在皮肤与眼睛中,以Diet 6(14/0)组显著高于其他各组(P<0.05),在脑中,以Diet 3(6/7)组显著高于除Diet 6的其他各组(P<0.05);(3)皮肤与眼睛中MC1R mRNA表达量以Diet 6(14/0)组显著高于其他各组(P<0.05),而在脑中各组差异均不显著(P>0.05)。综上所述,在本试验条件下,饲料不同浮萍添加水平促进大正三色锦鲤TYR以及MC1R基因表达,有利于鱼体黑色素沉积,因此选择Diet 6(14/0)组饲料投喂大正三色锦鲤最适。

RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响

旨在研究RNAi对羊驼黑色素细胞中MC1R表达量及黑色素合成的影响。合成3对MC1RsiRNA,将MC1RsiRNA瞬时转染羊驼黑色素细胞,qRT-PCR法检测MC1R mRNA表达量,细胞免疫组化技术对MC1R进行定位,利用吸光度值检测黑色素细胞中黑色素的合成量。结果显示,siRNA2组和siRNA3组的MC1R mRNA相对表达量极显著低于空白对照组(P<0.01),siRNA1组和阴性对照组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05),siRNA2、siRNA3两组的黑色素合成量低于空白对照组,差异极显著(P<0.01)。将MC1RsiRNA成功转染到羊驼黑色素细胞中,筛选出有效MC1RsiRNA,MC1R的抑制情况与黑色素合成量一致,说明黑色素细胞中MC1R对黑色素的合成具有调控作用,其作用机制需进一步研究。

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。

不同毛色贵州水牛MC1R、TYR基因SNP研究

[目的]为促进贵州白水牛资源保护与开发的科学性,同时为品种选育提供更加充分的科学依据。[方法]本实验以贵州水牛(灰色)为对照组,以贵州白水牛为实验组分别构建DNA池,对不同毛色贵州水牛的MC1R基因和TYR基因进行PCR扩增并确定SNP位点,并利用生物信息学软件分析突变位点对RNA的二级结构,蛋白质的二、三级结构的影响。[结果]在贵州水牛(灰色)和贵州白水牛扩增的MC1R基因中共同筛选到错义突变exon1-T843C,导致缬氨酸(Val)变成丙氨酸(Ala),还在贵州水牛(灰色)中筛选到exon1-C1228T(同义)、exon1-G1330A两个突变位点。在两种水牛扩增的TYR基因共同筛选到2个错义突变exon1-G826A、exon5-T70C,分别导精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突变为异亮氨酸(Ile);1个同义突变exon3-A83G。