NLRP3炎症小体抑制剂MCC950通过抑制Th1/Th17和促进Tregs改善脓毒症小鼠器官损伤

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体抑制剂MCC950对脓毒症小鼠T细胞分化及器官损伤的影响。方法:将18只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组(sham组)、脓毒症模型组(CLP组)和MCC950治疗组(MCC950组),每组6只。其中CLP组和MCC950组通过盲肠结扎穿孔(CLP)的方法制备脓毒症模型。MCC950组腹腔注射溶于0.5 mL 0.9%氯化钠溶液的MCC950(50 mg/kg),sham组和CLP组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。CLP术后24 h收集小鼠血清及器官标本。HE染色法观察脓毒症小鼠肺脏、肾脏组织病理损伤程度,并计算生存率;Western blot法检测脾脏NLRP3蛋白含量;ELISA法检测小鼠血清和肺组织的细胞因子水平(IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α);分离脾脏获得脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术检测辅助性T细胞(Th)1、Th17、调节性T细胞(Tregs)比例。结果:与sham组相比,CLP组小鼠肺组织炎性细胞浸润、水肿和肺泡壁增厚,肾小管刷状缘和上皮细胞减少,肾小球萎缩,肾小管成弥漫性扩张,大量炎性细胞浸润,脾脏NLRP3的蛋白表达上调(P<0.05),血清IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05),肺组织中IL-1α、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05),脾脏CD4^(+)IFN-γ^(+)Th1、CD4^(+)IL-17^(+)Th17、CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)Tregs比例均升高(P<0.05),小鼠7 d生存率为30%(P<0.05)。与CLP组相比,MCC950组小鼠肺组织炎性细胞浸润减轻,水肿减退,肾小管扩张不明显,炎性细胞浸润亦有所减轻,脾脏NLRP3的蛋白表达下调(P<0.05),血清IL-1β、IL-18、IL-1α、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05),肺组织中IL-1α、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05),脾脏CD4^(+)IFN-γ^(+)Th1、CD4^(+)IL-17^(+)Th17比例减少,CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)Tregs比例明显增加(P<0.05),小鼠7 d生存率显著提升(P<0.05)。结论:MCC950阻断NLRP3可改善脓毒症小鼠的器官损伤,其作用可能依赖于抑制Th1/Th17反应和促进Tregs反应。

MCC950下调NLRP3炎症小体对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响

目的探究MCC950下调NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响。方法将60只小鼠随机分为对照组、COPD组和MCC950组。采用脂多糖联合香烟烟雾的方法复制COPD大鼠模型。HE染色分析各组大鼠肺组织病理变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;Westernblotting检测各组大鼠NLRP3相关蛋白表达;检测大鼠嗜酸性粒细胞及趋化因子水平。结果与对照组比较,COPD组大鼠肺组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相对表达量升高(P<0.05);肺组织表现出严重病理损伤和炎症细胞大量聚集(P<0.05);血清MMP-2、MMP-9、TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05),TIMP-1和TIMP-2水平降低(P<0.05);细支气管壁厚度、管壁面积和管壁面积/腔周长均增加(P<0.05);静脉血嗜酸性粒细胞水平增加(P<0.05)。预先注射MCC950后,以上指标均得到逆转(P<0.05)。结论MCC950下调NLRP3炎症小体后,能够影响COPD大鼠气管重塑,改善COPD大鼠的肺组织损伤,以及降低静脉血嗜酸性粒细胞的水平。

MCC950抑制NLRP3炎性小体活性改善阿尔茨海默病模型小鼠血脑屏障功能研究

目的研究核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体抑制剂MCC950对侧脑室注射淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致的阿尔茨海默病(AD)模型小鼠血脑屏障(BBB)结构和功能的影响。方法将小鼠随机分为假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组(1.3 mg/kg)和MCC950组(10 mg/kg),除假手术组外,其余各组侧脑室注射Aβ25-35制作小鼠AD模型,造模后第2天,各给药组按相应剂量连续给药21 d,每日1次,假手术组给予等量0.9%氯化钠溶液;于第15天进行Y迷宫实验,第16~21天进行Morris水迷宫实验;行为学实验后进行伊文思蓝渗漏实验并取材;ELISA试剂盒及免疫荧光染色法检测小鼠脑组织中NLRP3水平,Western blot法检测小鼠脑组织海马及皮质中紧密连接蛋白-5(claudin-5)、闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱天冬氨酸酶(caspase-1)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、p53上调凋亡调节因子(PUMA)、抑癌因子p53、核转录因子κB(NF-κB)的表达情况。结果与假手术组相比,模型组小鼠自发交替反应率下降,水迷宫的游泳潜伏期较长,穿越平台次数及目标象限路程减少,脑内伊文思蓝渗透率显著增加,NLRP3表达增多,claudin-5、occludin、ZO-1表达明显减少;ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α、PUMA、p53、NF-κB表达明显增加。与模型组比较,给药组小鼠自发交替反应率升高,水迷宫潜伏期较短,穿越平台次数及目标象限路程增加,小鼠脑内伊文思蓝含量降低,NLRP3表达明显减少,claudin-5、occludin、ZO-1明显增加;ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α、PUMA、p53、NF-κB表达明显减少。结论MCC950可通过PUMA/NF-κB和PUMA/p53信号通路抑制NLRP3炎性小体活性来改善AD模型小鼠血脑屏障功能。

MCC950通过抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体改善高蛋白质饮食雏鹅生长性能、尿酸代谢和肾脏损伤

本试验通过评估MCC950对高蛋白质饮食雏鹅生长性能、尿酸代谢、血清炎症因子含量和肾脏损伤的影响,探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)信号通路在雏鹅痛风中的可能作用机制。试验选取1日龄扬州雏鹅120只,随机分为3个组,分别为对照组、高蛋白质组(HP组)和高蛋白质+MCC950组(HP+MCC950组),每组5个重复,每个重复8只。对照组饲喂粗蛋白质为16.5%的正常蛋白质饲粮,HP组和HP+MCC950组均饲喂粗蛋白质为24.0%的高蛋白质饲粮,且HP+MCC950组每3 d按10 mg/kg BW剂量腹腔注射1次MCC950,其他2组注射等量生理盐水。试验期15 d。结果表明:1)与对照组相比,HP组雏鹅15日龄时的平均体重显著降低(P<0.05);HP组血清尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(UN)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)含量均显著提高(P<0.05);HP组肾脏组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),肾脏组织中NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白相对表达量显著提高(P<0.05)。2)与HP组比较,HP+MCC950组雏鹅10和15日龄平均体重均显著提高(P<0.05);HP+MCC950组血清UA、Cr、UN、CRP、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和TGF-β1含量均显著降低(P<0.05);HP+MCC950组肾脏组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),肾脏组织中NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。3)HP组雏鹅肾小管扩张,发生空泡变性、坏死,而HP+MCC950组肾小管结构较为清晰;HP组雏鹅肾脏组织中尿酸盐沉积面积显著大于对照组(P<0.05),HP+MCC950组肾脏组织中尿酸盐沉积面积显著小于HP组(P<0.05);雏鹅肾脏组织尿酸盐沉积面积与NLRP3蛋白相对表达量呈显著正相关(r=0.681,P<0.05)。综上所述,MCC950可促进高蛋白质饮食雏鹅生长,降低血清尿酸含量,可能与其抑制NLRP3/Caspase-1信号通路减轻炎症反应和肾脏损伤有关。

MCC950的作用靶点及其在中枢神经系统疾病治疗中作用机制研究进展

MCC950是一种特异性的小分子抑制剂,可以透过血脑屏障选择性地阻断核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的激活,减少下游IL-1β的成熟和释放。MCC950抑制NLRP3炎症小体激活的作用靶点主要是NIMA相关蛋白7、凋亡相关斑点样蛋白、氯离子和核苷酸结合寡聚化结构域中的Walker B基序等。MCC950通过抑制NLRP3/IL-1β通路的激活来减轻炎症反应,在治疗多种中枢神经系统疾病方面显示出良好的疗效,例如MCC950可通过抑制NLRP3/IL-1β通路从而保护多巴胺能神经元,改善帕金森病;MCC950通过阻断NLRP3炎症小体激活,逆转Aβ诱导的体内炎症反应的发生来改善阿尔兹海默病;MCC950还可阻断创伤性脑损伤病灶处的神经凋亡,产生神经保护作用;MCC950治疗可以削弱内质网应激,从而对癫痫产生治疗作用。

MCC950对线粒体损伤相关分子模式诱导大鼠肺损伤的保护作用

目的严重创伤诱发的急性呼吸窘迫综合征目前尚无特异性治疗策略,探讨MCC950对线粒体损伤相关分子模式(MTDs)诱导肺损伤的影响,初步分析其作用机制。方法将40只SD大鼠采用随机数字表法分为对照组、MTDs组、MCC950组和MTDs+MCC950组4组,MTDs+MCC950组采用腹腔注射MCC950(20 mg/kg)预处理SD大鼠1 h后,经尾静脉注射MTDs(5%体积肝[5])到大鼠体内;对照组注射等渗盐水;MTDs组腹腔注射等渗盐水,尾静脉注射MTDs;MCC950组腹腔注射MCC950,尾静脉注射等渗盐水,12 h后麻醉,腹主动脉放血处死。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18含量,BCA法检测BALF中蛋白含量,称重以计算肺湿重/体重比值(LWW/BW),采用HE染色后光镜观察组织病理学改变,Smith肺损伤评分评价肺损伤情况,Western blot检测Pro-Caspase-1和Caspase-1蛋白表达。结果与对照组相比,MTDs组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量显著增多(P<0.05),MCC950组差异无统计学意义(P>0.05),MTDs+MCC950组中TNF-α含量显著增多(P<0.05),而IL-1β和IL-18差异无统计学意义(P>0.05);与MTDs组相比,MCC950+MTDs组BALF中IL-1β和IL-18含量显著减少(P<0.05)。与对照组相比,MTDs组LWW/BW比值明显增大[(4.19±0.36)mg/g vs(6.32±0.54)mg/g,P<0.05],BALF中蛋白含量明显增多[(0.12±0.03)g/L vs(0.79±0.07)g/L,P<0.05];与MTDs组相比,MCC950组、MCC950+MTDs组LWW/BW比值[(4.35±0.29)mg/g、(4.47±0.46)mg/g]明显降低(P<0.05),BALF中蛋白含量[(0.12±0.06)g/L、(0.15±0.06)g/L]明显减少(P<0.05)。Smith肺损伤评分统计分析表明,与对照组相比,MTDs组肺损伤评分明显增高(1.00±0.00 vs 8.33±0.58,P<0.05);与MTDs组相比,MCC950+MTDs组肺损伤评分明显降低(8.33±0.58 vs 3.67±0.58,P<0.05)。与对照组相比,MTDs组Pro-Caspase-1和Caspase-1蛋白水平明显增高(P<0.05);与MTDs组相比,MCC950+MTDs组Caspase-1蛋白条带灰度降低,蛋白表达水平降低(P<0.05),Pro-caspase 1无明显变化(P>0.05)。结论 MCC950可能通过抑制NLRP3炎性体活化对MTDs诱导的肺损伤发挥保护作用。

Mcc950在新生儿坏死性小肠结肠炎的作用及其机制研究

目的研究NLRP3炎症小体及其特异性抑制剂Mcc950对新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的作用及机制。方法将120只1日龄新生SD乳鼠随机分为对照组、NEC组和Mcc950治疗组,每组40只。通过人工喂养、缺氧复氧、冷刺激加脂多糖(LPS)灌胃建立NEC动物模型。采用HE染色观察各组肠组织病理表现,并对肠组织行损伤评分;采用蛋白质印迹技术和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测炎症因子IL-1β和IL-18、炎症小体NLRP3、细胞焦亡主要标志分子Caspase-1和GSDMD的蛋白及mRNA表达水平。结果与对照组相比,NEC组大鼠体重减轻,肠上皮细胞排列紊乱,部分绒毛坏死、脱落,黏膜层、黏膜下层及固有层可见水肿分离,相应的肠组织损伤评分升高,IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白及mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与NEC组相比,Mcc950治疗组大鼠体重下降趋势变缓,肠组织病理损伤减轻,肠组织损伤评分降低,IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1和GSDMD表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立NEC模型,Mcc950可抑制NLRP3介导的炎症及细胞焦亡,从而在NEC中发挥保护作用。

MCC950阻断小胶质细胞焦亡对大鼠脑出血预后的影响

目的 研究核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体抑制剂MCC950通过抑制小胶质细胞焦亡对大鼠脑出血预后的影响。方法 54只成年雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,按简单随机法将其分为对照组、脑出血组和MCC950治疗组,每组18只。对照组仅做钻孔处理;脑出血组经胶原酶诱导脑出血;MCC950治疗组在使用胶原酶诱导脑出血之前,先通过侧脑室注射MCC950。Longa五级评分1~3分为造模成功,分别于造模成功后24 h和72 h对3组大鼠相关指标进行检测及组间比较,即利用蛋白免疫印迹(WB)分析和免疫荧光测定血肿周围组织中小胶质细胞NLRP3炎性小体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)和成熟白细胞介素1β(IL-1β)的蛋白表达量,同时行苏木素-伊红(HE)染色观察炎性细胞浸润程度。用干湿重法测定脑水肿,用改良神经功能损伤严重程度评分(mNSS)评估大鼠脑出血恢复程度。取27只新生SD乳鼠(0~24 h),提取原代小胶质细胞,随机分为对照组、凝血酶激活组、MCC950治疗组,每组细胞数为5×10~5个/ml,共2 ml。对照组为不进行任何干预措施;凝血酶激活组应用20 U凝血酶进行激活;MCC950治疗组使用0.2 nmol MCC950干预1 h后加入20 U凝血酶激活。于干预后24 h分别对3组原代小胶质细胞相关指标进行检测及组间比较。透射电镜下观察小胶质细胞形态,检测细胞焦亡的发生,并测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率。应用WB法分别测定3组小胶质细胞中NLRP3、活化Caspase-1、成熟IL-1β和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白表达量。结果 (1)体外实验结果显示,对照组、凝血酶激活组、MCC950治疗组小胶质细胞LDH释放率分别为(4.0±0.5)%、(21.0±0.7)%、(14.0±0.8)%,3组间差异有统计学意义(F=1 178.172,P<0.01);凝血酶激活组LDH释放率高于对照组,MCC950治疗组LDH释放率低于凝血酶激活组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。(2)体外实验结果显示,对照组、凝血酶激活组、MCC950治疗组NLRP3相对水平分别为43.8±1.1、79.1±3.1、77.9±3.0,Caspase-1相对水平分别为32.0±2.1、86.4±2.6、70.1±6.8,IL-1β相对水平分别为56.2±1.8、87.8±5.7、65.4±13.5,ASC相对水平分别为40.8±1.6、124.7±3.3、59.7±1.6,3组间小胶质细胞不同蛋白相对表达水平的差异均有统计学意义(F值分别为187.286、121.755、10.886、1 086.027,均P<0.01)。与对照组比较,凝血酶激活组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白表达明显增加(均P<0.01);与凝血酶激活组比较,MCC950治疗组中Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白表达明显降低(P<0.01或P<0.05)。在NLRP3表达水平方面,MCC950治疗组与凝血酶激活组的差异无统计学意义(P>0.05)。(3)体内实验中,对照组、脑出血组和MCC950治疗组大鼠NLRP3相对表达水平分别为78.2±2.5、126.2±2.4、66.4±3.9,Caspase-1相对表达水平分别为33.3±1.2、82.3±1.9、43.6±1.0,IL-1β相对表达水平分别为14.4±1.7、114.7±2.6、48.0±3.1,3组大鼠NLRP3炎性小体信号通路中不同蛋白相对水平的组间差异均有统计学意义(F值分别为732.738、1 000.585、1 204.343,均P<0.01)。与对照组相比,脑出血组血肿周围NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达显著增加(均P<0.01);与脑出血组相比,MCC950治疗组血肿周围NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达显著降低(均P<0.01)。(4)体内实验中,对照组、脑出血组和MCC950治疗组大鼠24 h mNSS分别为(2.3±0.8)、(12.1±0.8)、(9.7±0.7)分,72 h mNSS评分分别为(2.5±0.5)、(9.3±0.8)、(7.2±0.8)分,24 h水肿程度分别为(79.46±0.20)%、(81.58±1.67)%、(81.13±0.16)%,3组大鼠24、72 h mNSS及24 h脑组织水肿程度的组间差异均有统计学意义(F值分别为849.933、219.729、7.886,均P<0.01)。与对照组相比,脑出血组24、72 h mNSS及24 h脑组织水肿程度均增加(均P<0.01);与脑出血组相比,MCC950治疗组24、72 h mNSS均降低(均P<0.01),24 h脑组织水肿程度的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MCC950可通过抑制NLRP3炎性小体从而抑制小胶质细胞焦亡,并改善大鼠脑出血的预后。

NLRP3炎性小体抑制剂MCC950对急性痛风性关节炎大鼠的保护作用

目的:研究NLRP3炎性小体抑制剂MCC950对急性痛风性关节炎大鼠的保护效果,并探讨MCC950抗急性痛风性关节炎的作用机制。方法:选取雄性SD成年大鼠,踝关节腔注射单钠尿酸盐(monosodium urate,MSU)晶体建立急性痛风性关节炎模型,注射生理盐水为对照组,注射MSU+MCC950为治疗组,每组7只。测量各组间踝关节肿胀程度,膝关节滑膜组织病理切片炎症细胞浸润情况,血清中的白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,关节滑膜组织NLRP3的表达量。结果:治疗组接受MCC950干预后,大鼠关节肿胀程度减轻,血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均下降,关节滑膜组织NLRP3表达量均下调(P<0.05),各项指标均得到显著的改善。结论:NLRP3炎性小体抑制剂MCC950对MSU诱导大鼠急性痛风性关节炎具有保护作用。

Mcc950对H_2O_2诱导的ARPE-19细胞炎性损伤的保护作用

目的:探讨Mcc950对过氧化氢(H_2O_2)诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)炎性损伤的保护作用。方法:将ARPE-19细胞分为正常对照组、H_2O_2损伤组、单纯Mcc950给药组、Mcc950预处理+H_2O_2损伤组,采用CCK-8法检测细胞活力并确定H_2O_2和Mcc950合适的实验浓度,ELISA法检测细胞分泌的IL-1β浓度,免疫印迹(Western blot)法检测细胞中NLRP3炎性小体相关蛋白的表达情况,TUNEL染色法观察细胞凋亡情况。结果:细胞活力随H_2O_2刺激浓度的增加逐渐下降,H_2O_2浓度为400μmol/L时细胞活力显著降低;而0.1、1μmol/L Mcc950对细胞活力无显著影响,故选取400μmol/L H_2O_2和1μmol/L Mcc950作为合适的实验浓度。与正常对照组相比,H_2O_2损伤组细胞活力显著降低,细胞上清液中IL-1β浓度显著升高,细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),而与H_2O_2损伤组比较,Mcc950预处理+H_2O_2损伤组细胞活力明显升高,细胞上清液中IL-1β浓度和细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,H_2O_2能够促进细胞中NLRP3、Pro-caspase1和caspase1的表达,而Mcc950预处理+H_2O_2损伤组细胞中NLRP3、Procaspase1依然保持高表达,但caspase1表达水平得到明显抑制,表明Mcc950能有效抑制NLRP3炎性小体的激活从而干扰具有细胞凋亡作用的成熟caspase1的产生。结论:Mcc950能够有效抑制H_2O_2诱导的NLRP3炎性小体激活,恢复细胞活力,抑制细胞凋亡。

MCC950对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域受体-3(NLRP3)炎性体抑制剂MCC950对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的保护作用和治疗价值.方法通过气管注入LPS制作ALI小鼠模型.取用30只清洁级C57BL6雄性小鼠,采用随机数字法随机分为三组:对照组(Control组)、LPS组和MCC950干预组(LPS+MCC950组),每组10只.LPS组小鼠气管内注入LPS溶液(3 mg/kg),LPS+MCC950组小鼠在LPS处理后1h经腹腔注射MCC950溶液(50 mg/kg).LPS处理后6h收集标本,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变,检测肺脏湿干质量比值,酶联免疫吸附法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞介素(IL)-1β和IL-18水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NLRP3、适应分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)在肺组织中的表达及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)裂解生成情况.另外60只小鼠用于观察各组小鼠的5d生存率,其中LPS气管注入剂量调整为10 mg/kg.结果与Control组比较,LPS组肺组织病理损伤(肺损伤评分:2.30±1.49 vs.11.20±1.87,P<0.05)和肺组织水肿(肺湿干质量比值:4.06±0.40 vs.6.73±0.52,P<0.05)均显著加重;BALF中细胞因子IL-1β(pg/mL:8.34±2.09 vs.200.40±18.22,P<0.05)、IL-18(pg/mL:13.51±3.57 vs.224.10±13.35,P<0.05)释放显著增加,肺组织中NLRP3、ASC和pro-caspase-1蛋白表达含量虽均未见显著增加(P>0.05),但pro-caspase-1裂解生成caspase-1 p10显著增加(P<0.05).给予MCC950干预后,与LPS组比较,LPS+MCC950组肺组织病理损伤(肺损伤评分:11.20±1.87 vs.6.90±1.66,P<0.05)和肺组织水肿(肺湿干质量比值:6.73±0.52 vs.5.14±0.43,P<0.05)均显著减轻;BALF中细胞因子IL-1β(pg/mL:200.40±18.22 vs.97.76±10.17,P<0.05)、IL-18(pg/mL:224.10±13.35 vs.124.70±10.49,P<0.05)释放显著减少,肺组织中NLRP3、ASC和pro-caspase-1蛋白表达含量虽均未见减少(P>0.05),但pro-caspase-1裂解生成caspase-1 p10显著减少(P<0.05).在LPS(10 mg/kg)诱导小鼠ALI模型中,与Control组比较,LPS组小鼠的5d生存率显著下降(100%vs.15%,P<0.05);与LPS组比较,LPS+MCC950组小鼠的5d生存率显著改善(15%vs.50%,P<0.05).结论MCC950对LPS诱导的ALI小鼠具有保护和治疗作用,其作用机制与特异性抑制NLRP3炎性体活性、减轻炎症反应有关.

MCC950对脑出血大鼠神经损伤的作用

目的:研究NLRP3炎性小体抑制剂MCC950对脑出血(ICH)大鼠神经损伤的作用。方法:72只SD大鼠随机分为3组(n=24):sham组、ICH组和MCC950组。ICH组和MCC950组采用自体非抗凝血注射方法建立大鼠脑出血模型后,给予MCC950组大鼠腹腔注射MCC95010 mg/kg(2 mg/ml),连续给药3 d。模型建立72 h后,进行前肢放置实验、转角实验和mNSS评分,观察ICH大鼠神经功能情况;新鲜脑组织切片,观察血肿体积变化情况;HE染色,观察脑组织病理学改变情况;干湿比重法,观察脑组织水肿变化情况;FJC染色,观察神经元退化的情况;TUNEL染色,观察神经元凋亡情况;Western blot,观察NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD蛋白表达及激活水平的情况。结果:与sham组比较,ICH组大鼠左前肢放置成功百分比和左侧转身百分比显著下降(P<0.01,P<0.05),mNSS评分显著升高(P<0.01),右侧脑内血肿体积显著增大,血肿周围脑组织中小胶质细胞数量增加,神经元数量减少,神经细胞肿胀,排布不均,部分细胞固缩性坏死,染色加深,右侧基底部含水量显著增多(P<0.05),血肿周围脑组织中FJC阳性和TUNEL阳性细胞数量显著增加(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1比值、GSDMD-N、GSDMD、GSDMD-N/GSDMD比值、IL-1β和IL-18水平显著升高(P<0.01,P<0.05)。与ICH组比较,MCC950组大鼠左前肢放置成功百分比和左侧转身百分比显著升高(P<0.05),mNSS评分显著降低(P<0.01),右侧脑内血肿体积显著减小,血肿周围脑组织中神经细胞肿胀显著减轻,固缩坏死细胞数量减少,右侧基底含水量显著减少(P<0.05),血肿周围脑组织中FJC阳性和TUNEL阳性细胞数量显著减少(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1比值、GSDMD-N、GSDMD、GSDMD-N/GSDMD比值、IL-1β和IL-18水平显著降低(P<0.05)。结论:MCC950可以通过抑制NLRP3炎性小体介导的炎症反应和细胞焦亡改善ICH后的神经损伤。

MCC950在野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型中的治疗作用及其机制研究

目的探讨MCC950是否可缓解野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压。方法雄性SD大鼠27只,采用数字表法随机分为对照组、MCT组和MCT+MCC950 3组,MCT+MCC950组于腹腔注射MCT第16天给予MCC950干预,每2d 1次,共7次。至第31天,检测右心室收缩压、右心肥厚指数;观察肺细小动脉结构,计算血管中膜厚度百分比(media thickness,MT%),检测肺组织中NLRP3、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和相关分子的mRNA及蛋白表达情况。结果与对照组比较,MCT组RVSP升高显著[(50. 72±3. 65) mm Hg (1 mm Hg=0. 133 k Pa) vs (24. 29±1. 28) mm Hg,P=0. 000],而MCT+MCC950组与MCT组相比显著降低[(34. 19±1. 94) mm Hg vs (50. 72±3. 65) mm Hg,P <0. 01]。对照组右心肥厚指数为0. 29±0. 01,MCT组(0. 61±0. 04)明显较高,差异有统计学意义(P=0. 000),MCT+MCC950组与MCT组相比降低(0. 48±0. 03 vs 0. 61±0. 04,P <0. 01)。与对照组比较,MCT组大鼠各级肺血管MT%均显著增高(P=0. 000),MCT+MCC950组与MCT组相比降低,且差异有统计学意义(P <0. 01)。MCT组大鼠肺组织中NLRP3、IL-1β和相关分子的mRNA及蛋白表达较对照组均上调,而MCT+MCC950组肺组织中NLRP3、IL-1β和相关分子的表达量与MCT组相比均降低。结论 MCC950可能通过抑制NLRP3信号通路明显改善肺血管重塑,延缓肺动脉高压进程,具应用于肺动脉高压治疗的潜在价值。

MCC950介导NLRP3-Caspase1-IL-1β炎症通路调控癫痫易感性

目的探究核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白受体3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 3,NLRP3)抑制剂MCC950对癫痫小鼠的神经保护机制。方法建立戊四氮(pentetrazol,PTZ)慢性点燃癫痫模型;记录行为学;采用RT-PCR检测小鼠海马NLRP3、Caspase1、IL-1βmRNA表达;Western blot检测蛋白表达;HE染色检测病理变化。结果MCC950干预组痫性发作有明显改善;NLRP3、IL-1β和NF-κB mRNA及蛋白表达下降;海马病理损伤减轻。结论MCC950可抑制NLRP3-Caspase1-IL-1β炎症通路,对癫痫有保护作用。

MCC950对心肌梗死大鼠心功能的保护作用及其机制

目的探究MCC950对心肌梗死(MI)大鼠心肌氧化应激和线粒体功能障碍的作用及其机制。方法将30只SD大鼠随机分成假手术组、MI组和MMC950组,每组10只。通过结扎冠状动脉前降支建立MI模型。超声心动图检查大鼠心功能,HE染色观察大鼠心肌组织病理形态表现,荧光探针法检测大鼠心肌组织活性氧(ROS),ELISA检测大鼠心肌组织中氧化应激因子水平,Western blotting检测大鼠心肌组织核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体及线粒体分裂、融合和生物发生相关蛋白表达。结果MCC950改善大鼠心功能和心肌组织病理损伤,降低大鼠心肌组织ROS水平、丙二醛含量、凋亡相关斑点样蛋白斑点形成数及NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD-N、Drp1和Fis1蛋白表达水平,增加心肌组织超氧化物歧化酶含量及OPA1、Mfn2、PGC-1α和TFAM蛋白表达水平。结论MCC950可改善MI大鼠心功能,抑制心肌氧化应激,促进心肌线粒体融合和生物发生,抑制线粒体分裂,其机制可能与其抑制NLRP3炎症小体激活有关。

NLRP3炎症小体抑制剂MCC950改善非酒精性脂肪性肝炎形成的机制研究

目的:研究NLRP3炎症小体小分子抑制剂MCC950在蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料诱导小鼠非酒精性脂肪性肝类(NASH)形成中的作用及分子机制。方法:C57BL/6小鼠用MCD饲料喂养4周的方式构建小鼠NASH模型。将实验分为Control组、单纯MCD饲养组(MCD组)以及MCD饲养且每隔2周经腹腔注射50 mg/kg的MCC950(MCC950组),4周后,测量各组小鼠及小鼠肝脏的质量,HE染色检测肝组织的病理改变,ELISA法检测血清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平。提取小鼠肝脏枯否细胞(KCs),检测NLRP3、NLRP3上游因子TLR4以及NLRP3下游因子IL-1β和IL18的蛋白表达。结果:C57BL/6小鼠通过MCD饲料喂养4周的方式成功构建小鼠NASH模型,体现在MCD组小鼠肝细胞气球样改变、大量炎症细胞浸润以及大量纤维结缔组织增生,血清炎症因子显著升高。MCD喂养也诱导KCs NLRP3活化以及下游细胞因子IL-1β和IL18的表达。MCC950组小鼠质量和肝脏质量显著高于MCD组,肝脏病理改变也显著减轻,炎症细胞浸润减少,纤维结缔组织增生减少。腹腔注射MCC950可以显著抑制MCD喂养介导的小鼠KCs NLRP3的活化,抑制下游细胞因子IL-1β和IL18的表达,但对NLRP3上游因子TLR4的表达无显著影响。结论:MCC950可以显著抑制MCD诱导的小鼠NASH形成,其分子机制可能与MCC950靶向抑制KCs NLRP3活化相关。

MCC950下调即早基因的表达缓解甲醛所致小鼠炎性痛

目的探讨MCC950对甲醛模型小鼠疼痛的影响及可能机制。方法 72只ICR雄性小鼠随机分为生理盐水对照组(NS组),甲醛模型组(F组)、不同浓度梯度MCC950干预组(6.25 mg/kg MCC950+F、12.5 mg/kg MCC950+F、25 mg/kg MCC950+F、50 mg/kg MCC950+F)。以小鼠累计舔咬足时间评价自发痛行为;采用Real-time PCR方法检测小鼠脊髓即早基因,包括c-Fos、Arc、早期生长反应因子-1(Egr-1) mRNA的表达变化;采用免疫组织化学法检测脊髓背角内c-Fos的表达。结果自发痛评分显示,与NS组相比,F组小鼠出现典型双相痛;与F组相比,12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg MCC950预处理均可显著缓解甲醛所致小鼠疼痛。Real-time PCR结果显示,与NS组相比,F组小鼠脊髓早期基因(c-Fos、Arc、Egr-1)的mRNA表达均上调,50 mg/kg MCC950预处理后,上述指标的mRNA表达均显著下调。免疫组织化学结果显示,与NS组相比,F组小鼠脊髓背角c-Fos表达明显增加,而用50 mg/kg MCC950预处理后,小鼠脊髓背角c-Fos表达下降。结论 MCC950可有效缓解甲醛所致小鼠炎性痛,其机制可能与下调脊髓即早基因(c-Fos、Arc、Egr-1)的表达有关。

MCC950抑制NLRP3/caspase⁃1通路改善体外循环大鼠围手术期神经认知障碍的作用研究

目的研究NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体抑制剂MCC950对体外循环(CPB)大鼠围手术期神经认知障碍(PND)的保护作用。方法清洁级成年雄性SD大鼠30只,体重350~450 g,采用随机数字表法分为3组(每组10只):假手术组(S组)、CPB组(C组)和CPB+MCC950(CM组)。S组不建模,C组和CM组建立大鼠CPB模型。CM组在CPB前24、1 h和术后24 h注射MCC95010 mg/kg,S组和C组注射等容量生理盐水。术后3 d大鼠进行水迷宫测试,记录逃避潜伏期和穿越平台次数。随后处死大鼠,取海马组织,采用酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素(IL)⁃18和IL⁃1β含量,分光光度法检测胱天蛋白酶(caspase)⁃1活性,免疫印迹法(Western⁃blot)检测NLRP3、凋亡相关斑点样衔接蛋白(ASC)、胱天蛋白酶原(pro⁃caspase⁃1)和消皮素D(GSDMD)蛋白含量,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测NLRP3、ASC、caspase⁃1 mRNA表达水平。结果与S组比较,C组和CM组大鼠逃避潜伏期较长(均P<0.05),穿越平台次数较少(均P<0.05);海马组织中IL⁃18、IL⁃1β含量和caspase⁃1酶活性较高(均P<0.05),NLRP3、ASC、pro⁃caspase⁃1和GSDMD蛋白含量较高(均P<0.05),NLRP3、ASC、caspase⁃1 mRNA表达较高(均P<0.05)。与C组比较,CM组大鼠逃避潜伏期较短(P<0.05),穿越平台次数较多(P<0.05);海马组织中IL⁃1β、IL⁃18含量和caspase⁃1酶活性较低(均P<0.05),NLRP3、ASC、pro⁃caspase⁃1和GSDMD蛋白含量较低(均P<0.05),NLRP3、ASC、caspase⁃1 mRNA表达较低(均P<0.05)。结论MCC950可抑制NLRP3/caspase⁃1通路改善体外循环大鼠PND。

NLRP3受体拮抗剂MCC950对脑小血管病大鼠的神经保护作用

目的探讨NLRP3受体拮抗剂MCC950对脑小血管病大鼠的神经保护作用。方法SPF级SD大鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(model)与MCC950组(MCC950),每组10只,通过结扎双侧颈总动脉的方法复制慢性脑缺血大鼠模型。Morris水迷宫观察各组大鼠认知功能变化;HE染色检测各组大鼠海马结构变化;免疫荧光染色检测各组大鼠海马星形胶质细胞(GFAP)与小胶质细胞(Iba-1)的活化情况;ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-18、IL-6及TNF-α的表达;Western blot检测NLRP3、pro-caspase-1及Caspase-1蛋白的表达情况。结果与模型组相比,MCC950组大鼠逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数显著增加,原平台象限时间占比显著延长,海马病理损伤减轻,GFAP与Iba-1活化明显被抑制,IL-1β、IL-18、IL-6及TNF-α的表达显著降低,且NLRP3、pro-caspase-1及Caspase-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论MCC950改善脑小血管病大鼠的认知功能,与抑制NLRP3炎症小体活性及减轻炎症反应相关。

MCC950能减轻线粒体损伤相关分子模式对 肺泡巨噬细胞的致炎效应

目的：观察一种化学合成小分子物质MCC950对线粒体损伤相关分子模式（MTDs）诱导肺泡巨噬细胞炎症反应的影响，并分析其可能的机制。方法利用差速离心法提取SD大鼠肝脏组织来源的MTDs。体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株，并分为空白对照组、LPS阳性对照组（1mg/LLPS刺激12h）、MTDs组（50、100、200mg/LMTDs刺激12h）、MCC950组（0.1μmol/LMCC950处理30min）、MCC950＋MTDs组（终浓度0.001、0.01、0.1、1.0μmol/LMCC950预处理30min＋100mg/LMTDs刺激12h）5组。收集各组细胞上清液及细胞，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、IL-18）含量；采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1及其前体（caspase-1、pro-caspase-1）、IL-1β及其前体（pro-IL-1β）的蛋白表达。结果①与空白对照组相比，50、100、200mg/L的MTDs刺激组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18含量均显著升高〔TNF-α（ng/L）：459.17±66.71、968.27±124.29、1128.6±172.02比34.67±11.66，IL-1β（ng/L）：341.57±38.09、685.00±75.36、784.97±89.28比26.33±8.04，IL-18（ng/L）：175.87±37.43、364.23±39.24、370.60±44.55比73.77±12.10，均P＜0.05〕，且呈剂量依赖性；并与LPS组具有类似的致炎作用。②与MTDs组相比，0.01、0.1及1.0μmol/LMCC950＋MTDs组细胞上清液中IL-1β、IL-18含量显著降低〔IL-1β（ng/L）：334.23±33.56、38.67±12.89、36.13±17.69比724.00±77.45，IL-18（ng/L）：165.77±25.47、71.37±5.99、66.80±14.61比412.23±40.15均P＜0.05〕，其中0.1μmol/L为产生抗炎作用的最佳有效浓度。而各浓度MCC950对TNF-α影响不大。③与MTDs组相比，0.01μmol/LMCC950＋MTDs组细胞中caspase-1及IL-1β蛋白表达显著下降（A值：14753.29±950.31比19222.50±1234.13，9981.06±673.63比12759.26±574.69，均P＜0.05），pro-caspase-1及pro-IL-1β蛋白表达无明显变化（A值：17856.08±1076.20比17059.01±966.37，23020.19±3463.57比20642.36±1714.36，均P＞0.05）。结论 MCC950能够减少MTDs诱导的肺泡巨噬细胞炎性因子分泌，可能通过抑制炎性体活化发挥作用。