一种筛选无青蟹呼肠孤病毒(MCRV)种蟹的荧光定量RT-PCR检测方法及其应用

青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一,青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业的高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播,本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度地提高检测灵敏性,首先,本研究分析MCRV在感染青蟹主要组织中的含量,发现血淋巴中病毒载量最高;随后,分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平,发现病毒VP11基因相对表达量最高;最后,基于VP11基因序列保守区设计特异引物,建立了一种SYBR Green quantitative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)检测方法,该方法可精确检测的病毒下限为50 copies/反应。该检测方法具有组织和靶标基因选择优势,灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测,均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约50μL/只)提取RNA,随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测,阳性率分别54.44%和85.00%。此外,利用该方法进一步分析了MCRV在较低温度下(21℃)在青蟹体内的增殖情况,发现病毒感染早期MCRV呈指数方式增殖,随后进入平台期,实验周期内无青蟹死亡。总之,本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法,既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选,也能满足病原感染相关研究的需要。

青蟹呼肠孤病毒和青蟹双顺反子病毒-1双重巢式PCR检测方法的建立

青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1,MCDV-1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在,给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中,快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物,建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex-nested PCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝,并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、虾类传染性表皮与造血组织坏死症病毒(IHHNV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、鱼类神经坏死病毒(NNV)和贝类急性病毒性坏死症病毒(AVNV)等水生动物常见病毒均无交叉反应,可以特异性地检测两种病毒。本方法具有高灵敏度、高特异性和简便快捷等特点,可作为一种快速诊断工具,检测拟穴青蟹中的MCRV和MCDV-1基因。

广东省阳江地区野生拟穴青蟹2种病毒感染情况调查

青蟹双顺反子病毒-1（mudcrabdicistrovirus-1，MCDV-1）和青蟹呼肠孤病毒（mudcrabreovirus，MCRV）是对养殖拟穴青蟹有较强致病性的2种病原，可导致高死亡率。文章采用双重巢式PCR检测法对2012年阳江地区5月-10月捕捞的野生拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）病毒感染情况进行调查。结果显示，阳江地区2012年5月～10月的野生青蟹群体一直保持较高的病毒携带率（44．83％-100％），其中MCDV-1检出率最高的月份为6月、8月和9月，MCRV检出率最高的月份为5月-6月和8月～9月；以单独感染类型为主的月份为5月、7月和10月（〉44．83％），以双阳性感染类型为主的月份为6月、8月和9月（〉82．76％）。由此可见，2种病毒的流行月份为5月～6月和8月～9月；在流行月份期间2种病毒常常协同感染野生拟穴青蟹。

广东沿海地区拟穴青蟹呼肠孤病毒和双顺反子病毒-1的分子流行病学调查

运用双重巢式PCR方法于2014年10月和11月份对广东省阳江市、台山市、中山市、惠州市(大亚湾地区、惠东地区)、汕尾市(东涌地区、红海湾地区)等主要拟穴青蟹(Scylla paramamosain)养殖地区的青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)流行情况进行检测调查和序列分析。结果表明在调查的地区中,60%—100%的拟穴青蟹至少携带一种病毒。10月份阳江地区、台山地区、中山地区、汕尾东涌和汕尾红海湾地区拟穴青蟹MCRV携带率分别为71.42%、68.97%、70%、72.41%和64%,MCDV-1携带率分别为61.29%、24.14%、63.33%、13.79%和12%;各地区两种病毒双重感染率均在50%以下。11月份阳江地区、台山地区、中山地区、惠州大亚湾地区和惠州惠东地区拟穴青蟹MCRV携带率分别为50%、95.65%、100%、93.1%和82.76%,MCDV-1携带率分别为10%、100%、93.1%、37.93%和27.59%,台山和中山地区地区两种病毒双重感染率均在90%以上,惠州、汕尾地区以单独感染为主。五个地区获得的27株MCRV序列中,各个地区内获得的核酸序列同源性均在99.2%—100%之间,MCRV序列遗传进化基本无地域差异;获得35株MCDV-1序列中,各个地区内获得的核酸序列同源性均在91.4%—100%之间,MCDV-1序列遗传进化出现一定的地域差异。