早产儿NEC与MD-2基因多态性相关性分析

目的探讨MD-2基因多态性与早产儿坏死性小肠炎(NEC)的相关性。方法选择2020年1月至2022年12月新生儿重症监护病房收治的确诊早产儿NEC120例(NEC组),采用基因测序方法对坏死性小肠炎患儿进行MD-2基因外显子和启动子功能性多态性区域重测序,将功能性多态点与同期非坏死性小肠炎的患儿120例(非NEC组)进行对照分析。结果NEC组中未检测出功能性多态性的位点,但两组均检测到C-1625G多态位点,且存在C/C和C/G基因型,NEC组C/C基因型频率为54.2%,C/G基因型的频率为45.8%,非NEC组C/C基因型频率为65.0%,C/G基因型频率为35.0%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。手术组C/C基因型频率为50.0%,C/G基因型频率为50.0%,与非NEC组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。NEC组G等位基因型频率为22.9%,非NEC组G等位基因型频率为11.7%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);手术组G等位基因型频率为10.4%,与非NEC组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组G等位基因频率与非手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论新生儿坏死性小肠炎发病与MD-2基因的外显因子的基因多态性无关,但疾病的严重程度可能与G等位基因有关。

利用荧光共振能量转移技术研究活细胞TLR4与MD-2作用结构域

脂多糖(LPS)的识别和信号转导是宿主发生防御反应的关键,Toll样受体4(TLR4)与髓样分化蛋白-2(MD-2)形成复合物在LPS的识别及其信号转导中发挥了重要作用.研究TLR4与MD-2结合的功能结构域,对于深入了解LPS信号转导机制及其内毒素休克的防治具有重要意义.运用基于强度的三通道荧光共振能量转移技术(FRET)及基因突变和转染技术,研究了活细胞TLR4与MD-2作用的结构域.结果表明:N端Glu24～Met41缺失使TLR4与MD-2结合能力明显下降;LPS刺激后TLR4聚合迅速增加,而缺失Glu24～Met41的TLR4不能聚合.上述结果提示,TLR4的Glu24～Met41不仅是结合MD-2的区域,并且还参与了LPS刺激后TLR4的聚合作用.

宣白承气汤对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA表达的影响

目的:探讨宣白承气汤对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)mRNA、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)蛋白及其mRNA表达的影响。方法:将32只雄性Wistar大鼠随机分为:正常对照组、模型对照组、地塞米松组、宣白承气汤组,每组8只。尾静脉注射LPS 6 mg/kg制备大鼠ALI模型。宣白承气汤组在造模前灌胃3 d,按7.56g生药/kg宣白承气汤水煎液灌胃,1次/d;地塞米松组在造模前1 h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松,造模6 h后麻醉取材。采用免疫组化ABC法和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达,并于光镜下观察大鼠肺组织病理变化。结果:与正常对照组相比,模型组MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达均明显上调(P<0.01);与模型组相比,地塞米松组和宣白承气汤组MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA表达明显降低(P<0.01);地塞米松组和宣白承气汤组相比无显著差异(P>0.05)。病理学观察,与正常组相比,模型对照组大鼠肺组织出现大片出血及坏死,宣白承气汤组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变明显轻于模型对照组,肺细支气管偶见炎症改变,水肿较轻,炎性细胞渗出较少。结论:宣白承气汤能减轻内毒素致ALI大鼠肺组织损伤,对肺损伤有保护作用,其机制可能与其能降低内毒素致ALI大鼠MD-2mRNA、MyD88蛋白及其mRNA的表达有关。

MD-2基因启动子区-1064、-1625 SNP对启动子活性的影响

目的探讨MD-2基因启动子区-1064、-1625SNP位点碱基变异对启动子活性的影响。方法通过PCR和定点突变技术,构建了含MD-2基因基础启动子及-1625G和-1064G突变启动子,以双荧光素酶报告系统观察SNP对MD-2基因启动子活性的影响。结果化学发光结果显示,在U937细胞中,-1625G突变启动子活性比MD-2基础启动子活性高11.4%,差异显著。而-1064G突变启动子与MD-2基础启动子活性无明显差异。结论-1625C→G碱基变异可增强MD-2基因启动子活性,但-1064SNP对靶基因启动子活性无明显影响。

鱼腥草挥发油和甲基正壬酮对LPS-TLR4/MD-2-TNF-α炎症通路的影响

目的探讨鱼腥草挥发油及其单体甲基正壬酮对LPS-TLR4/MD-2-TNF-α炎症通路的影响。方法以TLR4/MD-2阻断剂封闭TLR4/MD-2位点,分别运用蛋白免疫印迹法（Western blot）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）对鱼腥草挥发油和甲基正壬酮干预后细胞中TLR4蛋白和炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）的表达进行检测。同时建立二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型,对鱼腥草挥发油和甲基正壬酮的体内抗炎药效进行比较。结果在1～10μg·mL^-1浓度范围内短时干预时,鱼腥草挥发油对LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4蛋白的抑制作用优于甲基正壬酮,对炎症因子的作用与甲基正壬酮有一定差异。LPS＋TLR4/MD-2阻断剂＋药物干预组与LPS＋TLR4/MD-2阻断剂组比较,以挥发油干预后细胞中TLR4蛋白的表达差异无统计学意义（P〉0.05）,而以甲基正壬酮干预后细胞中TLR4蛋白的表达明显减少。表明鱼腥草挥发油通过LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路发挥其抗炎作用,而甲基正壬酮可能通过其他途径发挥其抗炎作用。在相同剂量下鱼腥草挥发油的体内抗炎活性优于甲基正壬酮。结论鱼腥草挥发油与甲基正壬酮存在抗炎作用及机制的差异性,应是挥发油中多成分协同作用的结果。

早期脓毒症大鼠肝TLR4和MD-2基因的表达及丙泊酚对其的影响

目的观察早期脓毒症大鼠肝Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白-2(MD-2)基因的表达,并以丙泊酚进行干预,比较肝TLR4、MD-2基因表达的差异。方法采用大鼠尾静脉注射脂多糖复制脓毒症模型。按完全随机化原则分为正常对照组(N组)、脂多糖组(L组)、脂多糖+丙泊酚组(LP组),每组20只。每组再依照注药后1、2、4、8 h随机分为4个亚组,各亚组5只。分别于相应时间点处死动物,留取肝脏标本,取肝右叶制成肝组织匀浆液(-20℃保存备用)。用凝胶定量分析软件Gel-Pro analyzer 4.0检测RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值,分析计算基因相对表达值。结果 (1)N组大鼠肝组织可见少量TLR4、MD-2 mRNA表达;(2)L组注射脂多糖后1 h TLR4、MD-2 mRNA表达较N组明显升高(P<0.05),之后渐下降(P<0.05);(3)与L组比较,LP组各时间点肝TLR4、MD-2 mRNA表达明显降低(P<0.05),但高于N组水平(P<0.05);(4)各组组内比较,肝TLR4、MD-2 mRNA表达水平均于1 h最高,之后逐渐下降(P<0.05);(5)TLR4 mRNA与MD-2 mRNA表达呈正相关(r=0.461,P=0.041)。结论 (1)正常大鼠肝组织内可见少量TLR4、MD-2 mRNA表达,脂多糖可迅速上调肝组织中TLR4、MD-2基因的广泛表达,丙泊酚干预后TLR4、MD-2 mRNA表达明显下调,对脓毒症大鼠有明显的治疗作用;(2)肝组织中TLR4、MD-2基因的表达与早期脓毒症的发生、发展密切相关,两种基因的mR-NA表达呈显著正相关,动态监测TLR4、MD2 mRNA改变对脓毒症发病及治疗过程具有一定的意义。

水牛MD-2 cDNA基因的克隆与原核表达

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定。采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,bMD-2基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;37℃条件下,经1 mmol/LIPTG诱导表达6 h后,His-bMD-2在E.coliBL21中表达量最高,并以包涵体的形式存在,融合蛋白的分子质量约为25 ku。结果表明水牛MD-2原核表达载体成功构建并表达,为继续深入对水牛MD-2基因功能的研究提供参考。

IL-15对儿童MDS造血前体细胞bcl-2、bcl-xl mRNA表达的影响

目的探讨IL-15对骨髓增生异常综合征(MDS)造血细胞bcl-2、bcl-xlmRNA表达的影响,以探索IL-15抑制MDSCD34造血干／祖细胞凋亡的可能机制。方法采用吸附单克隆抗体的免疫磁珠分离系统,分离纯化17例MDS患儿骨髓CD34细胞,采用RT-PCR检测bcl-2、bcl-xlmRNA表达水平,观察IL-15对它们的影响。结果IL-15可呈时间与剂量依赖性的增强体外培养的MDS造血前体细胞bcl-2、bcl-xl基因mRNA的表达。结论IL-15可能为抑制MDSCD34造血干／祖细胞凋亡的作用机制之一。

VEGF-C、COX-2、Cath-D在MDS患者血清中的表达及意义

目的探讨血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)、环氧化酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)、组织蛋白酶-D(cathepsin-D,Cath-D)在骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndromes,MDS)患者血清中的表达水平及意义。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测44例MDS患者、50例正常健康人血清中的VEGF-C、COX-2、Cath-D含量并进行比较。结果 MDS患者血清中VEGF-C、COX-2、Cath-D的表达水平明显高于正常健康对照组,差异有显著统计学意义(均P<0.01)。VEGF-C、COX-2、Cath-D的表达在不同性别、年龄比较中无统计学意义(均P>0.05),而在不同临床分型比较中VEGF-C、COX-2、Cath-D的表达与MDS分型呈正相关性。结论联合检测血清VEGF-C、COX-2、Cath-D的表达对MDS疾病的发展、治疗、预后有重要的作用。

大鼠自体原位肝移植后肺组织MD-2的表达及意义

目的观察自体肝移植后肺组织病理变化及MD-2、TLR2/4基因和蛋白表达变化。方法选取健康SPF级SD大鼠30只,随机分为假手术对照组(S组,n=6)和移植肝脏再灌注后4、8、16、24小时组(M4、M8、M16和M24组,每组n=6)。观察肺组织病理损伤,Q-PCR法检测MD-2、TLR2/4基因表达,Western Blot法分析MD-2、TLR2/4蛋白表达,ELISA法检测肺组织TNF-α和IL-6浓度。结果假手术组肺组织结构基本正常,移植组表现为肺间质明显出血、充血,中性粒细胞浸润显著增多,以肝脏再灌注后8小时最为明显。与S组相比,M4、M8、M16组肺组织MD-2、TLR2和TLR4基因与蛋白表达显著上调(P<0.05),在肝脏再灌注8小时时达到高峰。与S组比较,M8、M16和M24组肺组织匀浆的TNF-α和IL-6浓度显著升高,在肝脏再灌注8小时时达到高峰。结论大鼠自体原位肝移植术后肺组织MD-2、TLR2和TLR4基因与蛋白表达显著上调,TNF-α和IL-6浓度升高,可能对肝移植急性肺损伤起重要作用。

脂多糖作用巨噬细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化

目的探讨脂多糖作用小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h内细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化特点。方法分别用低剂量(100 ng/ml)和高剂量(1 000 ng/ml)脂多糖刺激RAW264.7,应用RT-PCR检测TLR4、CD14、MD-2m RNA水平的变化,ELISA检测细胞上清TNF-α含量的变化。结果低剂量脂多糖下调TLR4 m RNA表达,14 h降至最低,24 h维持在低水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达增加。高剂量脂多糖上调TLR4 m RNA表达,1 h上升至高峰,此后维持在高水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达也明显增强。高剂量脂多糖作用后TNF-α含量显著高于低剂量脂多糖(P<0.05)。结论高剂量脂多糖逆转低剂量脂多糖下调的TLR4表达,提高TLR4/CD14/MD-2受体复合物的表达水平,放大下游信号转导通路的炎症效应。

重组白细胞介素-2对急性白血病及MDS患者NK活性异常的逆转作用

用标准的^(51)Cr 释放法观察了12例急性白血病及白血病前期(MDS)患者的外周单个核细胞(PBMNCs)经重组白细胞介素-2(rIL-2)诱导3～4周后 NK活性及 LAK 活性的变化。结果诱导前 NK 活性(5.3±4.5%)较健康人(56.2±9.9%)明显减低(P<0.01)。rIL-2(1000u//ml)诱导3～4周后 NK 活性(46.9±8.6%)较培养前显著提高(P<0.01)。LAK 活性由0.80±0.83%升高到49.4±9.6%。同时在培养过程中也观察到淋巴细胞逐渐增多,而白血病幼稚细胞逐渐减少。这提示 rIL-2在体外能够逆转急性白血病及 MDS 患者 NK 杀伤功能缺陷,其 LAK 活性的诱导过程也是对白血病细胞的清除过程。

CD14、MD-2在LPS致乳腺上皮细胞炎症中的作用

目的:探究LPS致乳腺上皮细胞(MECs)炎症中白细胞分化抗原14(CD14)、髓样分化蛋白2(MD-2)的作用。方法:采用MTT法和流式细胞术检测LPS对小鼠MECs的刺激条件,PCR和流式细胞术检测MECs上CD14、MD-2的表达;siRNA沉默CD14、MD-2基因,通过流式细胞术检测FITC-LPS与细胞的结合率,ELISA法检测LPS介导炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β表达来研究CD14、MD-2在LPS致MECs炎症中的作用。结果:LPS作用于细胞IC50为76.83μg/ml;当5~10μg/ml浓度的LPS刺激细胞6~12 h时,LPS与细胞的结合趋于饱和;基因和蛋白水平都表明MECs上有CD14、MD-2表达,CD14、MD-2基因沉默后,LPS与小鼠MECs结合率被抑制,同LPS组相比分别下降7.88%、3.00%、13.41%(P<0.01),同时LPS介导细胞分泌TNF-α、IL-6及IL-1β的量(P<0.05、P<0.01)也显著或极显著下降。结论:MECs上有CD14、MD-2的存在,它们是乳腺细胞胞外LPS-TLR4炎症信号途径重要基因。

TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

目的:探讨TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:利用荧光定量PCR(Real-timePCR)检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TFmRNA表达,采用试剂盒检测细胞TF活性;利用自制的β2GPⅠ胶联亲和层析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)分析β2GPⅠ与THP-1细胞表面相应受体结合情况;Real-timePCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88、MD-2情况;观察TLR4途径抑制物——紫杉醇是否干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的作用。结果:Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞TF表达显著增加(P<0.05);THP-1细胞表面的TLR4能够结合于β2GPⅠ-Affi-Gel柱;Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2显著升高(P<0.05);紫杉醇(1μmol/L)能够抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应。结论:TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中具有重要作用。

超临界CO_2-分子蒸馏制备大蒜注射液

目的 :在低温 (6 0℃以下 )条件下制备大蒜注射液。方法 :超临界CO2 对大蒜有效成分进行萃取 ,用分子蒸馏进行分离纯化 ,用超滤法过滤除菌。结果 :注射液的各项指标符合中国药典 2 0 0 0年版附录IB注射剂项下的各项规定。结论 :超临界CO2

髓样分化蛋白-2在识别和转导内毒素信号中的作用

脂多糖(LPS)通过TLR4介导细胞炎症反应.研究表明,髓样分化蛋白-2(MD-2)通过与TLR4形成复合物参与LPS诱导的细胞信号过程.TLR4/MD-2复合物中的MD-2结合LPS后,引起TLR4低聚化,进而激发下游信号.MD-2合成后,大部分在内质网/高尔基体和TLR4结合,然后以TLR4/MD-2复合物的形式在细胞表面表达.这既能调节TLR4的胞内分布,又能辅助TLR4识别LPS.还有一部分MD-2释放到血浆中,形成可溶性的MD-2(sMD-2).sMD-2在CD14参与下,能结合血浆中的LPS,形成LPS-sMD-2复合物从而辅助只表达TLR4而不表达MD-2的细胞识别LPS,但过度表达的sMD-2又能抑制LPS信号.MD-2在TLR4介导的内毒素识别和信号转导过程中发挥了重要的调控作用.

中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 cDNA的克隆与原核表达

本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)基因,并用West-ern blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。

超临界CO_2萃取-分子蒸馏对当归的提取分离

目的 对当归的亲脂性化学成分进行研究。方法 采用超临界CO2 萃取当归中亲脂性成分 ,用分子蒸馏对提取物进行分离 ,用GC MS联用技术分离鉴定各自的化学组成 ,计算其相对含量。结果 超临界CO2 萃取物得率 2 .1 5 % ,从中鉴定出3N 丁基邻羟甲基苯甲酸内酯等 31种成分 ;萃取物经分子蒸馏的得率为 1 5 .8% ,从中鉴定出 35种成分。结论 超临界CO2 萃取和分子蒸馏可用于当归亲脂性成分的提取 。

bcl-2在鸡马立克氏病肿瘤中的表达

用来克亨SPF鸡复制马立克氏病 (Marek’sdisease ,MD)肿瘤模型 ,取肿瘤和相应正常组织 ,液氮保存。AGPC(AcidGuanidiniumThiocyanate Phenol Chloroform)法提取组织总RNA(TR NA) ,紫外测定其浓度 ,甲醛变性胶电泳观察其纯度。将一个含鸡bcl 2 1 2kb片段的质粒(PTTCB1) ,经转化扩增 ,提取质粒DNA ,限制性内切酶 (RE)消化 ,回收纯化bcl 2片段 ,放射性α 32P标记 ,制成探针。通过Northern分子杂交检测MD肿瘤组织中bcl 2的表达 ,并与相应的正常组织比较。结果 :鸡MD肿瘤组织和相应正常组织中均有bcl 2的表达 ;MD肿瘤组织中bcl 2的表达显著高于相应的正常组织。结合已进行的凋亡研究表明 ,bcl

TOLL样受体-4和髓样分化蛋白-2在血吸虫病小鼠肝脏的表达及意义

目的:探讨血吸虫病小鼠肝脏TOLL样受体-4(TLR-4)和髓样分化蛋白-2(MD-2)的表达及其在肝脏损害中的作用。方法:将40只健康小鼠随机分成正常对照组(N组,20只)与模型组(M组,20只),M组采用腹部敷贴法制作血吸虫病模型,造模150天后处死动物,鲎试验法测定血清内毒素水平;免疫组化和RT-PCR方法检测肝脏中TLR-4和MD-2的表达。结果:M组血清内毒素水平高于N组(P<0.01);M组小鼠肝脏TLR-4/MD-2表达水平高于N组(P<0.01);M组小鼠肝脏TLR-4/MD-2高表达主要位于肝窦内皮细胞及肝窦区周围细胞。结论:血吸虫病肝硬化可发生肠源性内毒素易位、内毒素血症;脂多糖通过其信号转导蛋白TLR-4和MD-2在肝脏的高表达,激活一系列促炎基因的转录,可能是引起血吸虫病肝脏损害的原因之一。