青葙苷A抑制缺氧乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭能力的研究

目的探索中药青葙子中的齐墩果烷型三萜化合物青葙苷A(celosin A,CA)对缺氧人乳腺癌MDAMB-231细胞的抗肿瘤作用及其相关机制。方法CoCl2造模MDA-MB-231细胞缺氧状态,建立细胞体外缺氧的CA给药培养体系。采用细胞计数试剂盒(MTT)检测细胞活力,免疫荧光法观察细胞形态学和核凋亡变化。流式细胞术(FCM)法检测细胞凋亡比例;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测CA对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制能力;Western blot实验检测缺氧相关蛋白表达水平和EMT标志蛋白表达水平。结果在缺氧状态下,高剂量的CA(20、40μmol/L)能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,诱导肿瘤细胞核凋亡的形态学改变,并且能有效促进早晚期细胞的凋亡率(PI-Annexin V-FITC促凋亡率:20μmol/L:+6.09%;40μmol/L:+18.50%),有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、单核细胞趋化蛋白(MCP)、血管内皮生长因子(VEGF)表达;同时低剂量的CA(5、10μmol/L)能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的Vimentin和N-cadherin因子的表达,并减少乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭细胞的数量(转移抑制率:5μmol/L,26.90%;10μmol/L,66.13%;侵袭抑制率:5μmol/L,23.71%;10μmol/L,75.00%)。结论CA能对缺氧乳腺癌MDA-MB-231细胞起到有效地诱导凋亡、抗肿瘤血管形成以及抑制侵袭与转移的作用。

Livin靶向RNA干扰对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的研究凋亡抑制蛋白Livin靶向RNA干扰MDA-MB-231对细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的机制。方法构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231后,通过RT-PCR、Western blot技术检测干扰前后MDA-MB-231细胞Livin、Caspase-3和Smac/DIABLO在mRNA、蛋白水平的表达;采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用,流式细胞法测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡以及观察细胞形态变化。结果成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体。它们不同程度地抑制了MDA-MB-231细胞Livin基因的表达,以si-Livin2抑制效率最高,它对Livin的mRNA和蛋白的抑制率分别达76.4%,70.2%。si-Livin2转染48 h后,与未转染组相比,细胞增殖活力受到抑制,转染48 h抑制率达36.1%。细胞周期重新分布,G0/G1期上升为(71.75±1.31)%,S期下降为(18.06±1.46)%;细胞凋亡率上升为(13.28±1.65)%;电镜下可见典型的凋亡细胞特征。细胞内Caspase-3, Smac/DIABLO的mRNA、蛋白表达有所上升。结论 Livin靶向RNA干扰通过上调Caspase-3, Smac/DIABLO表达有效地抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进凋亡。

用于活体成像的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建

目的构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系以建立可用于活体成像的三阴性乳腺癌裸鼠移植瘤模型。方法采用磷酸钙共沉淀的方法构建表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,体外感染MDA-MB-231细胞,经G418筛选得到稳定细胞系后,通过活体成像评价感染后细胞表达荧光素酶的情况,并通过MTT法、transwell肿瘤侵袭模型、细胞划痕实验等评价细胞的增殖、侵袭及转移能力是否改变;此外将细胞接种至雌性BALB/c-nu//nu裸小鼠的右侧第2对乳房垫内,构建乳腺癌原位肿瘤模型。利用活体成像系统监测体内肿瘤的生长及转移情况,并通过冰冻切片、HE染色评价细胞系在活体内的稳定性及成瘤能力。结果成功构建能稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的MDA-MB-231细胞系,荧光素酶的活性达到每细胞9689 photons/s,慢病毒的整合没有改变细胞的增殖、迁移及侵袭能力;成功建立了乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。结论(1)慢病毒以其高效稳定的感染率,应作为标记荧光素酶基因的首选载体;(2)带有荧光素酶的MDA-MB-231细胞在动物体内可被快速而灵敏的检测到,这将为人三阴性乳腺癌转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供一个直观、方便及灵敏的平台;(3)荧光素酶和荧光蛋白基因双标记优于单标记。

曲古菌素A对乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用

目的:研究组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭、细胞周期及ERα表达的影响。方法:100～400nmol/L的TSA分别处理MDA-MB-231细胞6～48h后用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测MDA-MB-231细胞的生长活性。应用流式细胞仪观察细胞周期的变化。采用RT -PCR法检测MDA-MB-231细胞在24h不同浓度100～400nmoi/L TSA作用下对ERα,MMP-9 mRNA表达的影响。采用免疫组织化学法检测MDA-MB-231细胞在24h不同浓度100～400nmol/L TSA作用下对ERα,MMP-9在细胞中表达的影响。采用细胞侵袭实验检测MDA-MB-231细胞在24h不同浓度100～400nmol/L TSA作用下细胞侵袭力的变化。结果:TSA可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,呈时间及剂量依赖性。TSA能够延缓细胞周期G_2/M期进程,阻滞细胞于G_2期。RT-PCR显示,TSA能够上调ERαmRNA在MDA-MB-231细胞中的表达,下调MMP-9在MDA-MB-231细胞中的表达。侵袭实验显示TSA能够较明显的抑制MDA-MB-231细胞的侵袭。结论:TSA能够较明显的上调ERα与下调MMP-9的表达可能是抑制MDA-MB-231细胞增生侵袭与转移的重要机制之一。

荜茇明碱对人乳腺癌MDA-MB-231细胞放射增敏作用

目的探讨荜茇明碱对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的放射增敏作用及其可能机制。方法体外培养MDA-MB-231细胞,取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组、X射线照射组、荜茇明碱处理组、荜茇明碱联合X射线照射组。克隆集落形成法分析荜茇明碱对MDA-MB-231细胞的放射增敏作用,按多靶单击模型拟合细胞存活曲线,确定存活分数(SF)、平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq),计算放射增敏比(SER)。用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡;用Western blot观察凋亡相关蛋白的表达;DCFH-DA探针结合FCM分析细胞内活性氧水平的变化。结果克隆形成试验显示,与单纯X射线照射组细胞相比,荜茇明碱联合X射线照射组细胞克隆形成能力下降,SF2、D0及Dq均下降(P均<0.05),其放射增敏比(SERD0)为1.22及1.29。与单纯X射线照射组相比,荜茇明碱联合X射线照射组细胞凋亡明显增加。与对照组和单独处理组相比,荜茇明碱与X射线联合处理组使Bcl-2表达明显减少,Bax的表达明显增加。荜茇明碱提高了X射线照射引起的细胞内活性氧的水平。结论低浓度的荜茇明碱增加了MDA-MB-231细胞的放射敏感性,可能与其调控凋亡相关蛋白表达并且升高细胞内活性氧水平,从而增加X射线诱导的细胞凋亡有关。

二甲双胍联合多西他赛对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

目的:通过二甲双胍联合多西他赛观察对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的抑制作用。方法:实验分为4组:多西他赛联合二甲双胍组、单用多西他赛组、单用二甲双胍组以及空白对照组。平板克隆实验检测多西他赛联合二甲双胍对MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响,MTT实验检测多西他赛联合二甲双胍对MDA-MB-231细胞克增殖能力的影响,流式细胞仪检测多西他赛联合二甲双胍对MDA-MB-231细胞凋亡能力的影响。结果:平板克隆实验、MTT实验和流式细胞仪凋亡检测实验结果分别显示:多西他赛联合二甲双胍中细胞的克隆率、增殖能力下降高于单用多西他赛组、单用二甲双胍组以及空白对照组(P<0.05),而凋亡率多西他赛联合二甲双胍组亦高于其它各对照组(P<0.05)。结论:二甲双胍联合多西他赛能够显著降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的克隆和增殖能力,同时增加MDA-MB-231的凋亡能力,两者的联合具有协同杀伤肿瘤细胞的作用。

氨氯地平对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭影响的体外实验

目的探讨氨氯地平对人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231体外侵袭的影响及其相关机制。方法用8.34μmol/L氨氯地平处理肿瘤细胞,以人工重组基底膜侵袭小室(Transwell)观察氨氯地平对MDA-MB-231细胞侵袭的影响;免疫细胞化学方法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix met-allo-proteinase,MMP-9)的表达。结果8.34μmol/L的氨氯地平可显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力,侵袭抑制率为36.27%;免疫细胞化学检测结果显示,MMP-9和VEGF蛋白的表达在MDA-MB-231细胞中亦明显降低。结论氨氯地平对MDA-MB-231细胞体外侵袭具有明显的抑制作用,此作用与降低肿瘤细胞的MMP-9和VEGF的表达有关。

大蒜素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭作用的影响

目的:探讨大蒜素对人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231体外侵袭的影响和相关机制。方法:用20mg/L大蒜素处理肿瘤细胞,以人工重组基底膜侵袭小室(Transwell)观察大蒜素对人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231侵袭的影响;免疫细胞化学方法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metallo-proteinase,MMP-9)的表达。结果:20mg/L的大蒜素可显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力,侵袭抑制率为33.27%;免疫细胞化学显示,MMP-9和VEGF蛋白的表达在MDA-MB-231细胞中亦明显降低。结论:大蒜素对人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231体外侵袭具有明显的抑制作用,此作用与降低肿瘤细胞的MMP-9和VEGF表达有关。

活化Notch3信号通路抑制MDA-MB-231细胞的增殖

目的 活化Notch3信号可以通过上调p27的表达抑制MDA-MB-231细胞的增殖.方法 用脂质体转染法将质粒转入体外培养的MDA-MB-231细胞,用Western印迹法和RT-PCR检测Notch3和p27基因的表达用CCK-8检测细胞增殖率;用平板克隆检测细胞克隆形成率;用流式细胞仪检测细胞周期.结果 Western印迹法和RT-PCR检测结果显示,在MDA-MB-231细胞中表达Notch3后,p27的表达上调.过表达Notch3后的MDA-MB-231细胞增殖减慢,第3天起差异均有统计学意义（P＜0.01）;克隆形成率降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;细胞周期阻滞在G0/G1期,转目的基因组G0/G1期细胞所占比例（72.47±1.75）％与对照组（60.16±3.29）％相比差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 活化的Notch3信号通路可以上调p27表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖.这一发现或许能为三阴性乳腺癌的分子靶向治疗提供新的思路.

Ghrelin抑制多柔比星诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的实验研究

目的:探讨Ghrelin抑制多柔比星诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的机制。方法 :通过细胞培养、MTT、流式细胞检测、Tunnel法和Western blot观察酰基化Ghrelin对多柔比星诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响。结果:MTT检测证实多柔比星能有效诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡。流式细胞检测及Tunnel法检测发现Ghrelin能有效抑制多柔比星诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡。Western blot检测发现Ghrelin抑制多柔比星诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的同时伴有bcl-2表达增加、bax表达下降、bcl-2/bax值升高。结论:Ghrelin能有效抑制多柔比星诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡,推测其抑凋亡机制可能与抗线粒体凋亡因子释放有关。

内质网应激诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞系凋亡

目的探讨内质网应激(ERS)致雌激素受体阴性(ER-)人乳腺癌MDA-MB-231细胞系凋亡及钙激活中性蛋白酶2(calpain2)在凋亡效应中的作用。方法实验设空白对照组(DMEM)、对照组(DMEM+DMSO)和实验组,用不同浓度衣霉素(TM)诱导乳腺癌细胞不同时间,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖抑制率及凋亡率;Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达量,以GRP78表达最高点确定ERS模型建立,检测凋亡相关蛋白caspase4和CHOP表达以及calpain及其内源性抑制酶calpastatin的表达,用ERS抑制剂(4-PBA)和calpain抑制剂(calpeptin)分别预处理细胞2 h,观察对上述效应的影响。结果 9、12和18μmol/L TM诱导ERS对该细胞增殖有明显抑制效应,抑制率分别为33.88%±1.32%、51.51%±8.85%和55.77%±2.61%,细胞凋亡率分别为9μmol/L TM组16.70%±0.46%和12μmol/L TM组28.1%±1.09%,与对照组相比有明显差异(P<0.05);9μmol/L TM诱导细胞24 h的GRP78表达上调最高(P<0.01);ERS还可明显上调caspase4、CHOP和calpain表达,下调calpastatin表达(P<0.01或P<0.05),上述效应均能被4-PBA和calpeptin减弱或阻断(P<0.05)。结论 ERS可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,calpain2参与调控凋亡发生。

红毛五加多糖对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖和核转录因子p53、c-myc蛋白表达的影响

目的探讨红毛五加多糖(AGP)对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖以及对细胞核转录因子p53、c-myc表达的影响。方法在DMEM培养基内加入不同浓度AGP(0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5 g/L)体外培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 1d、3d、5d、7d后,用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒WST-1测定人乳腺癌细胞的增殖,倒置显微镜观察其形态变化;用免疫荧光法、免疫印迹法检测人乳腺癌细胞凋亡相关蛋白p53、c-myc的表达。结果 WST-1法显示,不同浓度AGP作用3d、5d、7d后对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖具有抑制作用,与阴性对照组相比差异有显著性(P<0.05);抑制率与AGP剂量、作用时间呈依赖性。免疫荧光法及免疫印迹法显示,AGP作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231后,其细胞的c-myc表达明显减弱,并向细胞质内聚集;而免疫印迹法显示p53表达显著增强。结论 AGP具有抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的作用,这可能与AGP下调c-myc表达、上调p53表达有关。

半枝莲对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的研究半枝莲对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 MDAMB-231细胞株培养,分别用生理盐水、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL半枝莲处理细胞,分别于12 h、24 h和48 h应用酶联免疫检测仪测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期,采用Boyden小室法测定细胞迁移能力。结果半枝莲呈浓度和时间依赖抑制MDA-MB-231细胞生长;呈剂量依赖促进细胞凋亡100μg/mL时凋亡细胞比率最大为50.0%;呈剂量依赖性阻滞MDA-MB-231细胞周期,G_1期细胞比率,降低S期和G_2期细胞数;呈剂量依赖性抑制MDA-MB-231细胞的迁移,100 mg/mL时显著抑制MDA-MB-231细胞迁移。结论半枝莲浓度为100μg/mL时,可有效阻滞细胞周期,抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移。

稳定表达GRIK3乳腺癌MDA-MB-231细胞株的筛选及鉴定

目的构建稳定表达GRIK3的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为研究GRIK3在乳腺癌中的生物学功能奠定基础。方法以非病毒质粒3×Flag-GRIK3为模板,PCR扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体表达质粒重组连接,重组质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染293T包装细胞,将获得的重组慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞株,连续使用嘌呤霉素7天筛选稳定转染的细胞株。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况以鉴定稳定表达目的基因细胞株,采用QPCR和Western blotting分别检测稳定表达细胞株及空载体对照细胞中GRIK3的表达。结果 PCR成功扩增出目的基因,扩增后产物与慢病毒载体成功连接,连接后的重组慢病毒载体经DNA测序鉴定插入基因序列正确。重组慢病毒质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒Pmd2.G成功转染293T细胞,收集的慢病毒能够成功转染MDA-MB-231细胞,并且在显微镜下能够观察到稳定表达GRIK3 MDA-MB-231细胞中明亮的绿色荧光。QPCR结果显示,GRIK3 mRNA在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为5. 443±0. 459,显著高于对照组的1. 0±0. 152,差异有统计学意义(P<0. 01)。Western blotting结果显示,GRIK3蛋白在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为2. 502±0. 092,高于对照组的0. 653±0. 032,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论成功构建了重组GRIK3慢病毒载体,并筛选出稳定表达GRIK3蛋白的MDA-MB-231细胞株,为进一步探索GRIK3在乳腺癌发生、发展中的机制奠定了基础。

Sensitivity Evaluation of Two Human Breast Cancer Cell Lines to Tamoxifen through Apoptosis Induction

Tamoxifen citrate (TAM) has been used to treat breast cancer in women for many years. The com-parative effects of TAM in inducing apoptosis were evaluated in estrogen receptor-positive (ER- positive MCF-7) and estrogen receptor-negative (ER-negative MDA-MB-231) human breast cancer cell lines in vitro in order to determine if these two cell lines differ in their sensitivity to TAM. Mi-tochondrial membrane permeability potential disruption was assessed in both cell lines by a lip-ophilic cationic dye (DePsipher assay, Trevigen, Inc.) utilizing fluorescence microscopy. Using this specific fluorochrome, we were able to associate mitochondrial membrane disruption to early, mid-, and late apoptotic cells. TAM induced cell death via apoptosis in both ER-positive and ER- negative cells, however, apoptosis induction was more pronounced in ER-positive MCF-7 compared to ER-negative MDA-MB-231 breast cancer cells. These findings may have some therapeutic use in the treatment of estrogen dependent and estrogen independent breast cancer.

放射诱导对乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞周期及细胞凋亡的影响

目的研究经放射诱导的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞周期和细胞凋亡的变化特点，探讨其与放射敏感性间的联系。方法使用6 MV X线对MCF-7和MDA-MB-231细胞进行照射，采用克隆形成实验拟合细胞存活曲线，计算放射生物学参数：平均致死剂量（D0）、准域剂量（Dq）和2 Gy照射的存活分数（SF2），比较肿瘤细胞放射敏感性；Hoechst 33342染色法检测肿瘤细胞的凋亡率，PI染色检测细胞周期。结果经6 MV X线照射后，MDA-MB-231细胞的存活曲线较MCF-7细胞右移；MDA-MB-231细胞D0、Dq和SF2值均大于MCF-7细胞（1.603±0.023比1.233±0.027、1.76±0.04比1.03±0.10、0.639 3±0.008 2比0.398 1±0.018 5，t值分别为-17.981、-11.745、-20.596，P值分别为0.000、0.003、0.000）。MCF-7细胞在2、4、8 Gy照射后24 h及同一剂量6 Gy照射后12 h和48 h的凋亡率均高于MDA-MB-231细胞（t值分别为4.441、7.299、10.499、6.375、7.743，P值分别为0.011、0.002、0.000、0.003、0.001）。和未照射相比，这两种细胞照射后均出现了不同程度的G2期阻滞，MDA-MB-231细胞组中G2/M期细胞比例随照射后时间及剂量的增加而逐渐增高，直至照射后48 h也未见细胞周期的明显恢复；而MCF-7细胞在受到8 Gy照射后24 h及6 Gy照射后48 h，这种阻滞就开始逐渐解除，随之出现G0/G1期细胞比例增高[（65.80±0.56）%、（62.53±0.67）%]。结论2~8 Gy 6 MV X线照射可诱导MCF-7细胞发生G1和G2期阻滞，MDA-MB-231细胞发生G2期阻滞，从而导致MCF-7细胞出现更多的凋亡，这也可能是造成两者放射敏感性差异的原因之一。

齐墩果酸对卵巢癌细胞IGROV1和乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的抑制作用

通过细胞增殖抑制实验、MTT法检测肿瘤细胞的活性,研究了齐墩果酸(OA)对卵巢癌细胞株IGROV1和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的抑制作用.结果显示,齐墩果酸可降低IGROV1和MDA-MB-231的细胞增殖能力并呈剂量依赖性,半数有效抑制浓度IC50分别为36.58μg/mL和38.8μg/mL(P<0.01).表明齐墩果酸对这两株恶性肿瘤细胞具有抑制活性,且对IGROV1的抑制活性高于对MDA-MB-231的抑制活性.

定量沉默c-Met基因表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和化疗敏感性的影响

目的探讨定量沉默c-Met基因表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、表阿霉素化疗敏感性的影响及其可能机制。方法设计3条针对c-Met基因不同位点短发夹RNA(shRNA)片段,瞬时转染MDA-MB-231细胞,挑选出沉默效率最佳的shRNA,并设定scramble为阴性对照组,MDA-MB-231细胞为空白对照组。将沉默效率最佳的TA-shRNA连接到PSD400慢病毒载体中进行病毒包装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达针对c-Met的shRNA细胞系(PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231)及阴性对照组细胞(PSD400-scramble-MDA-MB-231)。利用多西环素(DOX)诱导稳定细胞系,Western blot检测稳定细胞系c-Met蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测敲低c-Met后对稳定细胞系增殖的影响。将诱导的稳定细胞系加入不同浓度表阿霉素,MTT法检测不同浓度表阿霉素作用对稳定细胞系存活率的改变,计算出药物半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白多聚二磷酸腺苷(ADP)-核糖聚合酶(PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达。结果稳定细胞系PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231经DOX诱导后细胞生长受到明显抑制,且加入不同浓度表阿霉素处理细胞后,细胞的存活率和IC_(50)均明显降低(P<0.05);同时G_(0)/G_(1)期细胞百分比明显升高,S期、G_(2)/M期细胞百分比明显降低(P<0.05)。Western blot检测凋亡相关蛋白PARP和caspase-3上调明显。结论定量沉默c-Met基因可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖,促进细胞凋亡,并提高了MDA-MB-231细胞的化疗敏感性,靶向c-Met基因可能是治疗乳腺癌的有效方法。

乳腺癌骨转移动物模型的构建

目的：建立乳腺癌骨转移动物模型。方法：40只4周~6周龄雌性裸鼠随机分为5组,每组8只,用浓度分别为1×105/ml、1×106/ml、5×106/ml、1×107/ml、5×107/ml的MDA-MB-231细胞悬液0.1ml行左心室注射。观察裸鼠左心室注射致死情况及存活裸鼠49 d后骨转移发生情况。结果：左心室穿刺注射总致死率为32.50%（13/40）;各组左心室穿刺注射致死率分别为1/8、1/8、1/8、3/8、7/8,组间比较差异有统计学意义（P=0.004）。全组骨转移发生率为48.15%（13/27）;各组骨转移发生率分别为0/7、3/7、5/7、4/5、1/1,各组骨转移发生情况差异有统计学意义（P=0.014）。结论：经裸鼠左心室穿刺注射肿瘤细胞成功建立了乳腺癌骨转移动物模型,肿瘤细胞浓度为5×106/ml时是经裸鼠左心室注射建立乳腺癌骨转移动物模型的适宜浓度。

携带IL-24的溶瘤腺病毒作用于乳腺癌的体外实验研究

目的构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,评估CNHK600-IL-24在体外对乳腺癌细胞的杀伤能力。方法将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-ΔCR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24。荧光显微镜观测及病毒体外增殖实验测评病毒在乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常成纤维细胞MRC-5中的增殖情况;MTT法检测不同MOI值的病毒对两种细胞的抑制效应;ELISA法检测病毒感染细胞后上清液中IL-24的含量;Western blot法检测细胞内的IL-24蛋白;流式细胞检测细胞的凋亡情况。结果 CNHK600-IL-24经测序及PCR鉴定,病毒滴度为1.9×1010pfu/mL。CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后表现出强大的增殖、复制能力,而在MRC-5细胞内增殖并不明显;CNHK600-IL-24在很低的浓度就能对MDA-MB-231细胞产生明显的杀伤效应,而对MRC-5细胞的杀伤作用明显减弱;CNHK600-IL-24感染MDA-MB-231细胞后,IL-24蛋白的表达明显增多,而感染MRC-5细胞后产生的IL-24维持在很低的水平。流式细胞检测发现,病毒引起的MDA-MB-231细胞明显凋亡而MRC-5细胞的凋亡率很低。结论本研究成功构建高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600-IL-24,该病毒具有在乳腺癌细胞中特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力。