MDCK-MDR1细胞药物体外吸收模型的建立及验证

目的构建MDCK-MDR1细胞体外吸收模型并进行验证,以用于口服药物吸收和转运机制的研究。方法将不同浓度组(1.0×10^(8)/L的L组、2.5×10^(8)/L的M组、5.0×10^(8)/L的H组)MDCK-MDR1细胞接种于24孔Transwell培养板上,培养1~7 d,通过吸光度值绘制MDCK-MDR1细胞生长曲线,观察不同培养时间点细胞的形态,测定不同时间点的跨膜电阻(TEER)值,确定形成单层膜结构的最佳细胞接种浓度和培养时间。通过荧光黄转运实验对不同浓度和时间点形成的单细胞膜结构进行验证。结果L组、M组和H组分别在接种后第5、3、1天形成单层膜结构,分别在第5、4、3天时吸光度值达到峰值。L组在接种第5天时TEER值达到300Ω·cm^(2),第5~7天趋于稳定,故确定形成单层膜结构的最佳细胞接种浓度为1.0×10^(8)/L,最佳培养时间为5 d。荧光黄转运实验验证显示,该单层膜结构的荧光黄表观渗透系数为4.27×10^(-7)cm/s,低于通透性试验规定的5.0×10^(-7)cm/s。结论本研究构建的MDCK-MDR1细胞模型单层膜结构完整性和通透性均通过验证,可作为模拟口服药物吸收和转运机制研究的体外模型。

安石榴苷在MDCK细胞单层模型上的转运机制研究

目的:采用MDCK细胞单层模型考察安石榴苷跨膜转运特性。方法:CCK8法筛选安石榴苷对MDCK细胞作用的安全浓度,Millicell-ERS测量细胞单层的TEER值确定细胞单层的完整性及致密性,考察给药浓度、方向、时间、温度、维拉帕米和EDTA-Na_2不同条件下安石榴苷的转运情况,采用HPLC法测定安石榴苷浓度,并计算表观渗透系数(P_(app))和外排率(ER)。结果:安石榴苷在MDCK模型上累积转运量具有时间和浓度依赖性,在100~300μg·ml^(-1)浓度范围内测得的顶侧(AP)到基底侧(BL)的Papp值为(6.13±0.12)×10^(-7)cm·s^(-1)、(6.96±0.26)×10^(-7)cm·s^(-1)、(5.94±0.10)×10^(-7)cm·s^(-1),未随浓度升高而增大,4℃时转运量降低,P-gp抑制药维拉帕米可以促进AP-BL方向的转运,加入EDTA-Na2后P_(app(AP-BL))显著增大。结论:安石榴苷以被动转运为主兼有主动转运参与,是P-糖蛋白(P-gp)的底物受到P-gp的外排作用,同时有细胞旁路转运途径。

MDCK-MDR1细胞模型及其在药物透过研究中的应用进展

本文介绍了MDCK-MDR1细胞系的特点、模型的建立,药物在其细胞模型上吸收转运的研究进展。概述了国内外关于利用MDCK-MDR1细胞系作为模型进行药物筛选、药物相互作用和研究药物吸收转运机制等方面的内容。MDCK-MDR1细胞系高表达P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),且P-gp呈极性分布,因而它可以作为药物转运模型快速筛选P-gp底物和抑制剂,以及肠道、血脑屏障、肾脏的体外模型。

鸡小肠原位单向灌流法和MDCK细胞系测定美托洛尔渗透性的影响因素

[目的]本试验旨在完善禽用药物生物药剂学分类系统(BCS)中药渗透性的准确测定方法。[方法]选取高渗透性内参药物美托洛尔,通过鸡小肠原位单向灌流法和体外过表达鸡P-gp的MDCK-chAbcb1单层细胞模型,探讨pH值(5、6和7)、药物浓度(4、40和400μg·mL^(-1))和小肠灌流部位(十二指肠、空肠和回肠)对美托洛尔渗透性测定的影响,为禽用药物BCS分类中渗透性测定方法的建立奠定基础。[结果]比较小肠不同部位在各自生理pH值条件下对美托洛尔的有效渗透系数(P_(eff))值时,发现回肠部位测得的P_(eff)最高(P<0.01),分别为十二指肠和空肠部位测得的2.2倍和2.3倍;原位灌流试验结果显示,灌流液pH值升高会增强药物在回肠的P_(eff)值,pH7时的P_(eff)值(1.35×10^(-4) cm·s^(-1))显著高于pH5时(0.72×10^(-4) cm·s^(-1)),同样在MDCK细胞中,随着pH值升高,药物渗透系数(P_(app))值均极显著升高(P<0.01);进一步采用受pH影响较小的空肠段进行灌流试验探讨不同药物浓度对渗透性测定的影响,发现增加肠灌流液中美托洛尔的浓度会极显著增加其P_(eff)值(P<0.01),4、40和400μg·mL^(-1)美托洛尔的P_(eff)分别为-0.48×10^(-4)、0.27×10^(-4)和3.04×10^(-4) cm·s^(-1),且在MDCK和MDCK-chAbcb1细胞测定的结果也显示,40和400μg·mL^(-1)美托洛尔的P_(app)值均显著高于4μg·mL^(-1)的(P<0.05),而40、400μg·mL^(-1)美托洛尔的P_(app)值间无显著差异(P>0.05)。[结论]机体内环境的pH值、药物浓度以及小肠灌流部位均可以影响体内外试验模型中药物渗透性测定的结果,故在建立药物渗透性测定方法时应充分考虑这些因素。

四氢帕马丁在MDCK-MDR1细胞系中的跨膜转运机制

目的:研究四氢帕马丁(tetrahydropalmatine,THP)在MDCK-MDR1单层细胞模型中的跨膜转运机制。方法:利用MDCK-MDR1单层细胞模型研究在有或无P-糖蛋白(P-gp)专属抑制剂维拉帕米时,THP双向转运特性,同时考察了温度、浓度对THP吸收的影响。采用HPLC法测定THP的含量,计算其表观渗透系数(Papp)。结果:当加入100μg/ml维拉帕米时,细胞单层顶端(apical,A)→基底端(basolateral,B)的Papp(A→B)增加,而B→A的Papp(B→A)显著降低。不加维拉帕米时外排率值为5.5,添加维拉帕米时外排率值为3.9。结论:THP在MDCK-MDR1单层细胞模型中的转运受到P-gp的外排作用,THP可能是P-gp的作用底物。THP跨MDCK-MDR1单层细胞转运具有温度依赖性和浓度饱和性。

岩白菜素在MDCK-MDR1细胞模型中的跨膜转运机制

目的研究岩白菜素透血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的转运机制。方法采用MTT法考察岩白菜素的无毒剂量范围;采用分子对接法预测岩白菜素与P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的相互作用(结合方式及作用力);采用体外MDCK-MDR1细胞模型模拟岩白菜素的透BBB跨膜转运,并分析透过-浓度关系、透过-时间关系以及P-gp抑制剂维拉帕米对其跨膜转运的影响。结果在5~40μmol·L^(-1)浓度范围内岩白菜素对MDCK-MDR1细胞无毒性;岩白菜素主要通过氢键和疏水作用与P-gp结合,复合物P-gp-岩白菜素的稳定性强于P-gp-维拉帕米;岩白菜素从顶(apical,AP)端到底(basolateral,BL)端转运的表观渗透系数(P_(app AP→BL))为(1.07±0.27)×10^(-6) cm·s^(-1)(t=90 min,c=20μmol·L^(-1)),外排率(efflux rate,ER)为4.32;岩白菜素与维拉帕米联合给药,岩白菜素的P_(app AP→BL)明显增大(P<0.01),P_(app BL→AP)明显减小(P<0.05),ER值减小至0.98。结论岩白菜素为透BBB中等的化合物,其跨膜转运过程除被动扩散外,还有P-gp的参与。

基于MDCK细胞模型的广防己体外肾毒性评价

目的采用MDCK细胞模型研究广防己的肾毒性,探讨MDCK细胞模型作为体外评价中药肾毒性方法的可行性。方法选择马兜铃和苦参作为阳性对照与阴性对照,通过MTT法测定细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态及乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜损伤,研究广防己对MDCK细胞的毒性作用。结果给药24 h后,各浓度的广防己组与阳性对照马兜铃组的细胞存活均被明显抑制,且倒置显微镜下可见细胞形态收缩变圆,部分细胞破裂脱落。通过比较乳酸脱氢酶的释放率,马兜铃与广防己对MDCK细胞膜的损伤明显高于阴性对照苦参组,统计学分析结果具有显著性差异(P<0.01)。结论 MDCK细胞模型可用于初步评价中药的体外肾毒性。

绿原酸跨细胞转运机制研究

目的利用Caco-2和MDCK细胞单层模型研究绿原酸(chlorogenic acid,CGA)的跨细胞转运过程及其机制。方法①Caco-2和MDCK细胞单层模型建立:Caco-2、MDCK细胞分别按密度1×105、5×104个细胞/cm2接种到Milli-cell-CM culture plate inserts上培养,待细胞单层达到一定致密程度后进行透过实验。②透过实验:用M2e酶标仪测定CGA在不同方向、不同浓度下的跨细胞转运情况并计算累积透过量。结果在两种细胞模型上CGA均有不同程度的双向跨细胞转运(吸收和分泌),P-gp抑制剂维拉帕米能明显减少CGA的分泌。结论CGA跨细胞转运同时存在吸收和分泌的动力学过程。P-gp部分参与CGA的分泌机制。

微小隐孢子虫感染犬肾细胞模型的建立及生长发育过程的研究

目的建立微小隐孢子虫体外感染犬肾细胞(MDCK细胞)模型,并观察其生长发育过程。方法利用MDCK细胞为隐孢子虫感染对象,优化隐孢子虫感染MDCK细胞的培养条件,观察隐孢子虫在MDCK细胞中的生长发育过程。将体外感染48h的细胞培养上清接种小鼠,观察其感染情况。结果在含有5%胎牛血清的DMEM培养基中,用1×105隐孢子虫卵囊感染2.0×105个MDCK细胞,培养12h为最佳培养条件。在感染后72h内,隐孢子虫出现连续发育阶段,包括脱囊、子孢子、裂殖子、裂殖体、滋养体、配子体、合子、薄壁卵囊和厚壁卵囊,在60～72h内形成卵囊;用感染48h的细胞培养上清接种于免疫抑制小鼠,10d后有隐孢子虫卵囊排出。结论建立了能稳定用于微小隐孢子虫体外感染的MDCK细胞模型,观察到隐孢子虫的生长发育全过程。

以hURAT1为靶点的排尿酸药物体外细胞筛选模型的建立和应用

人尿酸盐阴离子转运体1(human urate anion transporter 1,hURAT1)是人肾小管重吸收尿酸的主要转运蛋白,以hURAT1为靶点,筛选hURAT1抑制剂是近年来降尿酸药物开发的热点,因此建立hURAT1抑制剂体外细胞筛选模型具有重要的意义与实用价值。本实验首先构建了表达SLC22A1 2(hURAT1编码基因)的慢病毒载体,感染MDCK细胞后,通过G41 8筛选出稳转细胞株(稳转株);随后采用W estern-blot及免疫荧光方法检测目的蛋白的表达,并通过液闪计数仪检测hURAT1稳转株对[^(14)C]尿酸的摄取作用及hURAT1抑制剂苯溴马隆、丙磺舒对[^(14)C]尿酸摄取的抑制效果。实验结果显示,hURAT1稳转株目的蛋白表达量为对照稳转株的两倍,并且吸收尿酸的量明显大于对照细胞(P>0.001)。此外,实验中测得hURAT1稳转株对尿酸吸收的Km值为365.4μmol/L,苯溴马隆及丙磺舒对尿酸吸收的IC_(50)分别为0.1 8μmol/L和66.82μmol/L。以上结果表明,本实验成功构建了稳定表达hURAT1的MDCK细胞株,并建立了一套hURAT1抑制剂体外准确筛选和评价的方法体系。

实时荧光RT-PCR和MDCK细胞培养法在流感监测中的应用

目的利用核酸检测和MDCK细胞培养技术准确快速判断流感病毒及型别,为临床治疗和流感病毒的防控提供科学依据。方法将实时荧光RT-PCR法中未分出型别的流感病毒咽拭子标本用MDCK细胞进行病毒的分离培养,其培养物用血凝实验方法(HA)鉴定病毒分离是否成功、血凝集抑制方法(HI)和实时荧光RT-PCR方法分别进行流感病毒型别鉴定。结果核酸检测未分出具体型别的6份流感病毒咽拭子的MDCK细胞培养物在核酸检测和HI的型别鉴定全部为季节H3型。结论阿克苏地区自2008年开展流感病毒监测以来第一次出现流感样难确定型别的现象,同时也体现了核酸检测和病毒分离培养鉴定技术相结合能更好更快地监测出流感病毒的变化,为今后其他型别的流感病毒出现类似状况提供了更好的经验。

基于体外消化/MDCK细胞模型测定地龙中镉和砷的生物可给性及风险评估

为了考察动物药地龙中镉(Cd)和砷(As)的生物可给性,并对Cd和As的风险进行评估,本研究采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定了地龙中Cd和As的残留量;建立in vitro PBET (physiologically based extraction test)体外模拟消化/MDCK细胞模型考察地龙中Cd和As的生物可给性;分别采用危害指数法(HI)和暴露限值法(MOE)对于地龙中Cd和As的残留总量以及生物可给量的风险进行评估。结果表明:6批地龙中Cd和As的残留总量范围分别为8.319~33.606 mg·kg^-1和0.532~16.412 mg·kg^-1。经过MDCK细胞转运后,地龙中Cd的生物可给性在10.13%~64.16%之间;As的生物可给性在2.72%~46.57%之间。风险评估的结果表明:MDCK细胞转运前,所有批次地龙中As的MOE值以及Cd的HI值均大于1, As的风险可接受, Cd的风险不可接受;MDCK细胞转运后,除了1批地龙外,其余5批地龙中Cd的HI值均小于1 (风险降低至安全范围内)。本研究为更加客观、科学地评估中药中重金属对人体的健康风险,制定更加科学、合理的重金属限量标准提供重要的技术支撑。

马钱子生物碱类成分在MDCK-MDR1单层细胞模型中的转运机制研究

目的研究马钱子碱、士的宁在MDCK-MDR1单层细胞模型中的双向转运机制。方法 MTT法确定马钱子碱、士的宁对MDCK-MDR1单层细胞毒性范围,以MDCK-MDR1单层细胞为体外研究模型,考察转运时间、药物作用质量浓度、P-糖蛋白(P-gp)抑制剂维拉帕米对马钱子碱、士的宁的累积吸收浓度(Ccum)和表观渗透系数(Papp)的影响。结果马钱子碱和士的宁Papp均> 1×10^-5 cm/s,Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)均<2。马钱子碱、士的宁与维拉帕米合用,显著降低了Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)值。结论马钱子碱、士的宁以被动转运为主,P-gp抑制剂维拉帕米对其吸收有明显抑制作用,马钱子碱、士的宁可能是P-gp底物。

LC-MS/MS考察白芷香豆素成分对硫酸长春新碱肠道转运及药代动力学的影响

目的：研究白芷香豆素类成分欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素对硫酸长春新碱肠道转运及药代动力学的影响。方法：采用MDCK-MDR1细胞模型,考察欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素对硫酸长春新碱肠道转运的影响。采用LCMS/MS测定给药后不同时间血浆中药物浓度,研究欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素成分对硫酸长春新碱药代动力学的影响。结果：长春新碱配伍质量浓度为10.80,5.42,1.35 mg·L-1欧前胡素的表观渗透系数（Papp）分别为（0.287 2±0.026 6）×10-6,（0.351 5±0.041 6）×10-6,（0.294 9±0.006 8）×10-6cm·s-1,三者与硫酸长春新碱的Papp[（0.227 2±0.014 8）×10-6cm·s-1]比较有显著性差异（P〈0.05）。硫酸长春新碱与欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素配伍后药时曲线下峰面积（AUC0-t）分别为（343.50±10.29）,（348.70±27.99）,（235.70±17.56）μg·h·L-1,与硫酸长春新碱组比较有显著性差异（P〈0.01）。药峰浓度（Cmax）分别为（81.870±8.517）,（83.010±9.276）,（60.440±6.679）μg·L-1,与硫酸长春新碱组的比较有显著性差异（P〈0.01）。结论：白芷香豆素类成分能促进硫酸长春新碱的肠道转运,提高其生物利用度。

稳定表达人寡肽转运体1的细胞模型构建及应用

目的构建稳定表达人寡肽转运体1(hPepT1)的马丁-达比犬肾细胞模型(MDCK-hPepT1),并将其应用于中药单体中人寡肽转运体1抑制剂的筛选。方法构建重组质粒pcDNA3.1(+)-hPepT1,将其转染马丁-达比犬肾系细胞,经G418筛选后以有限稀释法挑选单克隆细胞。以人寡肽转运体1荧光底物β-Ala-Lys(AMCA)和经典底物Glysar对单克隆细胞转运活性进行验证;通过反转录聚合酶链式反应验证人寡肽转运体1在转录水平的表达。以中药单体对Glysar摄取的影响实现人寡肽转运体1抑制剂的筛选。结果获得的两株单克隆细胞(D19、A11)对β-Ala-Lys(AMCA)摄取均显著高于转染空载体的马丁-达比犬肾系细胞,对Glysar的摄取分别为转染空载体细胞的24、11倍;D19、A11中hPepT1的mRNA水平亦显著高于转染空载体的细胞;已知的人寡肽转运体1抑制剂(底物)显著减少单克隆细胞D19和A11对Glysar的摄取;部分中药单体对Glysar摄取产生不同程度的抑制。结论本实验成功构建了稳定高表达人寡肽转运体1的马丁-达比犬肾系细胞模型,并应用该模型筛选出对人寡肽转运体1具有潜在抑制作用的中药单体。

药物跨膜转运细胞模型影响因素及应用

本文详细介绍了Caco-2细胞系和MDCK细胞系的特点、跨膜转运细胞模型的建立及其影响因素,包括细胞模型的选择、细胞接种密度、细胞单层的紧密性等细胞因素和Transwell多微孔膜的性质等环境因素。概述了国内外关于利用Caco-2和MDCK细胞系作为模型进行药物筛选、药物相互作用和研究药物吸收转运机制等方面的内容及MDCK细胞模型作为肠道模型、肾脏模型及血脑屏障模型的应用。比较了Caco-2细胞和MDCK细胞在肠道模型方面的差别,MDCK细胞主要用于选择性研究药物在小肠吸收及转运机制,特别用于细胞旁被动转运药物的研究,而Caco-2细胞用于双向转运或能量依赖主动转运研究。MDCK细胞模型可在体外培养条件下平稳转染人类MDR1基因,因此可高表达P-gp基因,可作为可用于评估肾脏药物相互作用、快速进行候选药物筛选及研究药物转运机制的理想模型。

口服药物吸收的细胞模型研究进展

多种细胞模型如最常用的Caco-2和MDCK细胞,以及新近开发的MDCK-MDR1、M细胞、药物溶出/Caco-2细胞组合、HT-29和TC7细胞等均可用于口服药物吸收的评价,但也存在一定的局限性。本文综述各类细胞模型的特点及其应用等相关研究进展。