重组酵母鸡α干扰素的诱导表达及其抗MDV、NDV能力

【目的】获得鸡α干扰素重组酵母菌诱导表达的最佳诱导时间和甲醇的体积分数,并测定诱导表达产物对鸡马立克氏病毒(MDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的抑制能力。【方法】挑取2个鸡α干扰素重组酵母菌单菌落至BMGY培养基中培养,待菌液OD600为4左右时,分别转接至BMMY培养液诱导,1瓶每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇,另1瓶每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇,于24,48,72 h收集样品,备SDS-PAGE检测用。根据不同时间(24,48,72,96 h)诱导上清液表达量的差异,留用表达量最高时段的上清液,经初步纯化后,利用鸡胚成纤维细胞(CEF),分别测定重组酵母鸡α干扰素抑制MDV及NDV的能力。【结果】鸡α干扰素重组酵母菌在每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇诱导48 h时,或每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇诱导72 h时,重组酵母鸡α干扰素表达量均达到最高;且诱导上清液具有较好地抑制MDV、NDV的能力。【结论】获得了鸡α干扰素重组酵母菌小量发酵的最佳条件;获得的重组酵母鸡α干扰素对MDV和NDV有明显的抑制作用。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV)的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(Bovineviraldiarrheavirus/mucosaldiseasevirus,BVDV/MDV)是引起牛病毒性腹泻/粘膜病的病原,与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属.其基因组由5′非翻译区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(ORF)和3′非编码区(3′NCR)组成,编码结构蛋白P14、gP48、gP25、gP53及几种非结构蛋白.下面就BVD/MD的分子生物学研究进展做一综述,以便给该病的进一步防制奠定理论基础.

我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测

从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾11 省42 个不同鸡群收集临床有发病表现的828只病、死鸡的病理组织样品,用点杂交方法检测各个样品中马立克氏病病(Marek′s disease virus,MDV)、网状内皮细胞增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV) 、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus,CAV)的感染情况。结果表明:828 只病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为83. 94% (MDV)、61. 0% (CAV)和57.25%(REV),并且存在非常严重的双重感染(31. 16%)和三重感染(44. 69%),单重感染和阴性个体仅占15.34%和8.82%;在42个鸡群中的29个存在三重感染,占鸡群总数的69.05%,5个鸡群存在MDV和CAV的共感染,3个鸡群存在MDV和REV的共感染,二重感染占鸡群总数的19.05%,仅有2个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,11个省份均检测到了MDV、CAV和REV,表明了这三种病毒在我国的广泛分布及其在生产鸡群中的混合感染是导致当前我国养禽业生产性能下降、条件致病性疾病发生严重、临床腺胃肿大症状发生的重要原因。

免疫鸡MDV感染后羽毛根HVT的分离及HVT免疫对MDV抗原检测的影响

５只ＨＶＴ免疫鸡，实验感染ＭＤＶ后的第１～１０周期间，分别采用初次细胞分离培养物上清中的自由病毒粒子鉴定，ｄｏｔ－ｂｌｏｔＤＮＡ杂交和常规ＡＧＰ试验等方法，对并发感染鸡羽毛根进行了病毒及病毒抗原的动态检测与比较。结果显示，在上述羽毛根中可同时存在ＨＶＴ粒子和ＭＤＶＤＮＡ。ＨＶＴ可分离时间为ＭＤＶ攻毒后１～７周；ＭＤＶＤＮＡ最早检出时间为ＭＤＶ攻毒后的第１８～２２天，并达到其持续性（２２～７０ｄ）的检出率最高峰（１００％）；而ＡＧＰ法对此期间鸡只羽毛根ＭＤＶ抗原的最早检出时间在第２２天，且检出率很低。因此，羽毛病毒抗原ＡＧＰ检测法，对免疫鸡只或鸡群ＭＤＶ感染的诊断仍然是特异的，但较单纯感染的检测，其检出率更低，因而更难以反映出免疫鸡群中ＭＤＶ感染的真实状况。

贵州土鸡中ALV-J、REV和MDV的混合感染

禽白血病、网状内皮组织增生症和马立克病是禽类最为常见的3种肿瘤病,可导致家禽出现严重的免疫抑制,继发感染其他疾病,对养禽业危害巨大。出现混合感染时,疾病的致病力和致肿瘤能力都远大于单一感染,导致的免疫抑制也更为严重。

用斑点杂交法同时检测鸡群中的CAV MDV和REV

为研究鸡传染性贫血病毒(CAV)在鸡群中的感染状况以及马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮细胞增生病病毒(REV)在鸡群中的发病率,用斑点杂交法对山东省4个肉鸡场和2个肉种鸡场进行CAV、MDV和REV的检测,结果表明除一个肉种鸡场没有检测出REV以外,其他鸡场均同时检测出CAV、MDV和REV,并且发现直接从病料中检测CAV的阳性率(20％)远远低于将病料接种SPF鸡胚后的检出率(80％)。

鸡MDV meq基因对鸡胚成纤维细胞p53基因表达的影响

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中原癌基因p53的表达,并且48 h的表达量是72 h的18.8倍;在对CEF和转染前后48、72 h的细胞端粒酶活性测定时也发现,端粒酶活性在转染后48 h是转染后72 h的16倍。流式细胞仪检测发现meq基因使S期细胞比例较转染前有所上升,进一步印证了meq基因是MDV中致瘤的主要因素。

共表达MDV糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

Recombinant fowlpox viruses(rFPVs)coexpressing MDV gB and chicken type Ⅱ interferon (IFN-Ⅱ) gene were constructed by using different promoters of Ps and PE/L.rFPVs were selected and purified by blue plaque expressing β-galactosidase.The expression of MDV gB gene was confirmed by indirect immunofluorescence assay.The levels of MDV gB expressed in rFPV-gB-IFN under the control of the synthetic promoter Ps was same as that in rFPV-gB.The expression of IFN-Ⅱ was examined in chicken embryo fibroblast(CEF) by protection against vesicular stomatitis virus-induced cytopathic effect.The levels of IFN expressed in CEF was 640～1280 units/mL.When rFPVs were propagated in CEF,the plaque sizes of rFPV-gB were larger than those of rFPV-gB-IFN,the plaque formation units of rFPV-gB were also more than those of rFPV-gB-IFN.

雄激素受体拮抗剂MDV3100的合成研究

以3-三氟甲基-4-腈基-苯胺和二硫化碳为原料制备异硫氰酸酯4-异硫氰基-2-三氟甲基苯腈(2),以2-氟-4-硝基甲苯为原料,经氧化、酰胺化、催化氢化制得N-甲基-2-氟-4-氨基苯甲酰胺(5),5与2-溴异丁酸乙酯反应得到2-(3-氟-4-甲胺甲酰苯基)胺基苯胺-2-甲基丙酸乙酯(6),2和6在无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中缩合得到MDV3100(1),结构经MS和1H NMR确证,总收率18%(以2-氟-4-硝基苯甲酸计,n/n)。

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.

MDV和AIV主要保护性抗原基因在鸡痘病毒中的联合表达

将强启动子Ps插入载体7S中构建成插入载体7SP,将鸡马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白B(gB)基因和禽流感病毒(AIV)血凝素H9A基因共同克隆到插入载体7SP中,获得重组转移质粒7SPGA,通过酶切鉴定获得Ps-gB与P7.5-HA同向的转移质粒,再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA得7SPLGA,将质粒7SPLGA与禽痘病毒疫苗株共转染鸡成纤维细胞,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-Ps-gB-P7.5-HA,以间接免疫荧光法证实gB基因和HA基因同时得到表达。该研究为探索新型基因工程苗打下了良好的基础。

内蒙古白绒山羊小肠可吸收氨基酸模式对MDV和PDV组织游离氨基酸代谢影响的研究

选用3只体况良好,体重25～30kg的2周岁内蒙古白绒山羊半同胞羯羊,安装永久性十二指肠近端瘘管以及门静脉、肠系膜静脉、颈动脉、颈静脉慢性血插管进行试验。采用3×3拉丁方试验设计,3个试验处理的十二指肠氨基酸灌注模式分别为M、M90+C10、M80+C20。结果表明,小肠可吸收氨基酸模式对MDV和PDV组织SAA的净流量具有显著影响,其中Met随着绒毛模式所占比例的增加而显著提高(P<0105)。MDV组织Cys的净流量显著高于其小肠消失量。绒山羊胃肠道组织摄取了大量的BCAA。因此,在调整绒山羊小肠氨基酸模式时应注意BCAA,尤其是Leu的补充。小肠可吸收氨基酸模式对绒山羊体内氨基酸代谢的利用有显著影响,绒山羊小肠内理想的氨基酸模式应界于M90+C10和M80+C20之间。

表达MDVgB基因重组痘苗病毒的构建及保护性研究

以脂质体转染技术构建了表达鸡马立克氏病毒（ＭＤＶ）ｇＢ基因的重组痘苗病毒（ＲＶＶ－ｇＢ），表明该病毒在ＣＶ－１（猴肾细胞）细胞系内能稳定传代，经腹腔 １×１０（~6） ＰＦＵ·羽^（－１）将重组病毒、ＨＶＴ冻干苗及痘苗病毒分别按试验程序，免疫１日龄ＳＰＦ鸡，并于１５日龄以３×１０~２ＰＦＵ·羽^（－１）ＭＤＶ强毒株ＧＡ株攻毒，重组病毒和ＨＶＴ冻干苗匀获得较高的保护，结果证明了ｇＢ是ＭＤＶ的宿主保护性抗原．此研究为ＣＴＬ应答检测奠定了基础．

一例肉种鸡MDV和REV混合感染的诊断

近两年来一些肉种鸡养鸡户反映免疫过鸡马立克疫苗的鸡群仍发生肿瘤,且这种情况较往年大幅增多,病鸡因肿瘤细胞扩散至全身而迅速死亡,造成鸡群死淘率明显偏高,生产性能下降,给养殖户带来较大的经济损失.……

MSB-1培养物上清液对体内MDV作用的研究

研究了马立克氏病肿瘤细胞系（ＭＳＢ－１）培养物上清液对体内鸡马立克氏病病毒（ＭＤＶ）增殖的影响，结果表明，该上清液对体内ＭＤＶ的增殖无明显抑制作用；相反，可增加ＭＤ的发病率。另外，试验中发现，６日龄鸡对ＭＤＶ的易感性明显高于１日龄鸡。

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoRⅠ从质粒pUR MDVEgB中切下。两端补平后,插入到质粒pEFgpt12s的PstⅠ酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s gB。这个载体的特点是,它含有两个启动子,在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因,另一个反向启动子vvP7 5的下游是标记基因Ecogpt,它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s gB通过磷酸钙的方法转染用282E4株FPV感染3 4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选,得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测,证实了重组病毒中含有gB基因,并且gB糖蛋白也得到了表达。

奶牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV/MDV)病实证分析

采用酶联免疫吸附反应试验(ELISA),对南京某奶牛场的近期有流产史奶牛以及临场表现正常奶牛的血清进行BVDV及相应抗体的检测,再用反转录PCR(RT-PCR)技术对受感染奶牛所感染的BVDV类型进行分析。结果发现,该奶牛场近期有流产史奶牛BVDV重度感染,88个样本中,有84个检出BVDV,感染率高达97.62%,其中单独感染BVDV-Ⅰ(CP)型的比率有29.76%,单独感染BVDV-Ⅱ(NCP)型的比率为25%,同时感染两型的比率为42.86%。根据相对应的抗体检测结果发现有疑似持续感染(PI)牛存在。25个正常血清样本中,有8个样本检出携带有BVDV,且都是BVDV-Ⅰ(CP)型,与近期有流产史奶牛感染BVDV状况有明显差异,但由于正常血清样本数量过少,还需进一步深入研究。

马立克氏病病毒MEQ蛋白对MDV增殖影响的研究

在马立克氏病病毒 MDV致病机理的研究中 ,弄清致病基因 meq与病毒增殖之间的关系及其分子机制是十分重要的基础。以重组反转录病毒 (RCAS meq)感染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,使源于 MDV强毒参考株 (v MDV) GA株的 meq基因表达于宿主细胞内 ,然后再用 GA株感染这些细胞。通过利用 MDV强毒株特异的抗 pp3 8单克隆抗体所进行的“黑斑”试验以确定 MDV的增殖水平 ,并与未接种 RCAS meq的CEF进行比较。研究结果发现 ,细胞内表达的 meq基因产物可促进 GA株于体外培养细胞中的感染与增殖(病毒斑数增多 )。根据试验的结果 ,作者认为 meq基因在感染细胞内的表达水平是 MDV增殖以及进而能致病。

有机锗与MD疫苗接种对雏鸡人工感染vMDV保护效果的比较研究

试验通过给父母代种鸡伺喂合ＧＣ－１３２的饲粮，以获取富锗种蛋，经孵化后取富锗雏鸡并以普通雏鸡做对照，分别随机分组，于１日龄进行ＭＤ疫苗接种和（或）人工感染ｖＭＤＶ，配合饲料添加或不加锗的基础日粮，旨在对比观察有机锗与免疫对人工感染ｖＭＤＶ雏鸡的保护效果．试验结果显示：１）１日龄雏鸡人工感染ｖＭＤＶ取得成功；２）富锗雏鸡的发病率、死亡率和肿瘤检出率均明显低于普通雏鸡（Ｐ＜０．０５）；３）１日龄富锗雏鸡开始继续饲喂添加Ｇｅ－１３２的饲料，能进一步提高雏鸡对ｖＭＤＶ的保护率；４）１日龄感染ｖＭＤＶ同时单纯作ＭＤ疫苗接种．其保护效果不显著．研究结果首次证实．由富锗种蛋孵出的富锗雏鸡比普通雏鸡对ｖＭＤＶ有较强的抗病力；同时继续饲喂加锗日粮，可进一步提高对鸡马立克氏病及其肿瘤病变发生发展的抑制效果．从而提示：采取有机锗加免疫的综合措施．是防制鸡马立克氏病的一个高效、可行的新途径．