白藜芦醇通过MEK/ERK-SIRT1通路的激活调节酒精诱导的HepG2细胞凋亡损伤

目的:探讨白藜芦醇在酒精诱导的HepG2细胞凋亡中的调节能力,揭示白藜芦醇抗酒精性肝损伤的作用机制.方法:白藜芦醇预处理HepG2细胞24 h后,用酒精诱导凋亡的产生.MTT方法检测白藜芦醇处理组与非处理组HepG2细胞的细胞活力;用ELISA试剂盒检测不同实验组的细胞内总超氧化物浓度(total superoxide)和细胞总抗氧化能力(oxygen radical antioxidant capacity,O R A C);同时检测了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine-requiring aspartate protease,Caspase3)蛋白表达及应用荧光倒置显微镜观察了吖啶橙(acridine orange,AO)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色的细胞形态学改变;采用RT-PCR方法检测氧化应激调节凋亡通路中关键基因Caspase3,细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),ERK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)和沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 1,SIRT-1)mRNA的表达.结果:MTT结果显示,与对照组比较,25-100μmol/L白藜芦醇可有效对抗300 mmol/L酒精对HepG2引起的细胞不良反应使细胞保持较高的活力;AO/PI活细胞凋亡检测显示了酒精处理组有大量的橙色凋亡细胞,而白藜芦醇预处理组橙色细胞明显减少;Caspase3结果显示不同浓度的白藜芦醇均可以降低被酒精激活的Caspase3的活性,其Caspase3的活性降为2.12、1.46、0.90和0.75倍;细胞内总超氧化物浓度结果显示预处理100、50、25μmol/L白藜芦醇组含量明显低于酒精诱导组;而未经白藜芦醇预处理的酒精诱导组ORAC(45.26±2.75)明显低于100、50、25μmol/L白藜芦醇预处理组(65.74±1.64、68.14±6.06、70.81±6.35).RT-PCR结果显示,与300 mmol/L酒精比较,不同浓度白藜芦醇均可上调SIRT1与ERK mRNA表达量;50μmol/L和100μmol/L白藜芦醇均可明显上调MEK mRNA表达量;50μmol/L和100μmol/L白藜芦醇均可显著下调Caspase3基因mRNA的表达量.结论:本研究提示酒精可诱导氧化应激相关的凋亡产生,而白藜芦醇通过调节MEK/ERKSIRT1通路中基因的表达发挥抗凋亡作用从而削弱酒精诱导的氧化应激及凋亡的损伤作用.

MEK1/2抑制剂U0126对射频消融术后残留肝癌细胞系HepG2-H作用的研究

目的研究MEK1/2抑制剂U0126对肝癌射频消融术后残留肝癌细胞系HepG2-H的增殖、迁移和侵袭的影响。方法运用肝癌细胞系HepG2体外制作射频消融术后残留肝癌细胞系HepG2-H,通过细胞增殖、划痕、侵袭实验,观察实验组(加入10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L的U0126)和对照组(不加入U0126)细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果实验组(加入10、20、30μmol/L的U0126)的吸光度值分别为:(0.6929±0.08257)、(0.5084±0.06012)、(0.4549±0.07660),对照组吸光度值为:(1.1245±0.07971);组间差异有统计学意义(P<0.05);实验组的迁移面积分别为:(5640.2±285.4)mm^(2)、(5082.4±237.7)mm^(2)、(4821.7±246.3)mm^(2),对照组的迁移面积为:(6053.8±269.2)mm^(2),组间差异有统计学意义(P<0.05);实验组的每高倍视野细胞计数分别为:(164.2±18.89)个、(138.4±18.06)个、(129.4±18.54)个,对照组的每高倍视野细胞计数为:(226.6±16.81)个,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论U0126可抑制射频消融术后残留肝癌细胞HepG2-H的增殖、迁移和侵袭。

贝母素乙对肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响

目的探讨贝母素乙对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响。方法大鼠麻醉后,经气管软骨环间隙向心端穿刺,注入博莱霉素5mg/kg建立大鼠肺纤维化模型,假手术组大鼠在同样麻醉条件下气管内注入等容积生理盐水。术后第2天开始每天灌胃给药,假手术组和模型组给予蒸馏水,地塞米松组给予等容积地塞米松蒸馏水溶液,贝母素乙A组、B组分别给予等容积贝母素乙5、2.5mg/kg蒸馏水溶液。灌胃28d后,麻醉并颈动脉取血后处死大鼠,肺组织固定,包埋切片,常规脱蜡,行免疫组化SABC法检测肺组织MEK1/2、ERK1/2水平,Western blot法检测p-MEK1/2、pERK1/2水平。结果贝母素乙可显著降低肺纤维化大鼠的肺组织ERK1/2、MEK1/2水平(P<0.01),与地塞米松作用相似(P>0.05),贝母素乙A组、B组之间比较未见明显差异(P>0.05)。贝母素乙可以显著降肺纤维化大鼠的肺组织p-MEK1/2、p-ERK1/2水平(P<0.01),较地塞米松更为显著(P<0.01),贝母素乙B组较贝母素乙A组更为显著(P<0.01)。结论贝母素乙减轻博莱霉素致肺纤维化大鼠的MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化水平可能是其抗纤维化的作用机理之一。

MEK1-ERKs级联激活方式是调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制的重要机制

本研究通过阐明MEK1和MEK2亚型在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV2)复制中介导的Raf/MEK/ERK(简称ERK)通路活化中的作用,以期进一步阐明该通路调控病毒复制的机制.研究中应用了MEK抑制剂U0126、针对MEK1和MEK2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),以及用死、活病毒攻击易感细胞,分别检测细胞ERK通路的激活和病毒复制的水平.结果表明,HSV2活病毒感染能引起ERK通路双相激活,U0126则能有效地抑制该通路的活化以及病毒复制;而死病毒只能引起ERK通路早期时相激活;单独敲降(knockdown)MEK1可抑制死、活病毒引发的ERK通路早期时相激活及活病毒引发的晚期时相激活,而敲降MEK2未见对病毒引起的该通路双相激活产生显著影响.提示HSV2复制引起ERK通路双相激活是基于MEK1-ERKs方式调控的,这种信号蛋白激活传递模式在HSV2整个复制周期中具有重要的正调控作用.该结果进一步证明了本室的前期报道:MEK1和MEK2亚型在病毒复制时发挥的作用不同.这对揭示MEK激酶功能的复杂性和ERK通路调控HSV2复制的机制,具有重要的意义.

妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1对葡萄糖摄取率的影响及MEK/ERK通路蛋白的参与研究

目的分析妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1对葡萄糖摄取率的影响及MEK/ERK通路蛋白的参与作用。方法构建网膜素1过表达载体转染传代脂肪细胞,分析不同转染浓度(0μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg)脂肪细胞的葡萄糖摄取率。采用荧光定量PCR法、Western Blotting法和免疫细胞化学法分析MEK/ERK通路蛋白的表达变化。结果不同网膜素1转染浓度对脂肪细胞葡萄糖摄取率和MEK/ERK通路蛋白及IRS水平有明显影响,且随着网膜素1转染浓度的升高,葡萄糖摄取率逐渐升高(P<0.05),MEK、ERK1/2蛋白(P<0.05)、mRNA(P<0.05)水平逐步降低,而IRS-1蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1后细胞的葡萄糖摄取率及IRS明显升高而MEK/ERK通路蛋白表达降低,表明网膜素1过表达和MEK/ERK通路蛋白被抑制与葡萄糖葡萄糖摄取和胰岛素抵抗密切相关。

复方七芍降压片对SHR大鼠P2Y6、MEK1/2、ERK1/2及血管重塑标志物MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响

目的研究复方七芍降压片对自发性高血压大鼠(SHR)肠系膜动脉中G蛋白偶联受体P2Y6、酪氨酸激酶受体(MEK1/2)、丝裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)及血管重塑标志物基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)等蛋白表达的影响,探讨复方七芍降压片干预血管重塑的作用机制。方法将雄性SHR大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦片组(13.5 mg·kg^-1)、复方七芍降压片组(8.73 g·kg^-1),每组10只,另设10只WKY大鼠为正常对照组;灌胃给药,每日1次,连续给药6周。采用无创血压仪测定每周大鼠尾动脉血压;ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)水平;免疫组化法检测肠系膜动脉中P2Y6、MEK1/2、ERK1/2、MMP-9及TIMP-1蛋白的表达;肠系膜动脉组织HE染色后进行体视学分析,测量肠系膜动脉血管中膜厚度及相同位置的管腔直径,计算两者比值作为动脉壁厚度(WT)值。结果与正常对照组比较,模型组大鼠各周血压明显上升(P<0.01);肠系膜动脉P2Y6、MEK1/2、ERK1/2、MMP-9蛋白表达及MMP-9/TIMP-1比值、WT值明显升高(P<0.05,P<0.01),TIMP-1表达明显降低(P<0.01);血清中IL-1β水平明显升高(P<0.01)。药物干预后,与模型组比较,复方七芍降压片组各周血压均明显降低(P<0.01);肠系膜动脉P2Y6、MEK1/2、ERK1/2、MMP-9蛋白表达及MMP-9/TIMP-1比值、WT值均明显降低(P<0.05,P<0.01),TIMP-1表达明显升高(P<0.05);血清中IL-1β水平明显降低(P<0.05)。结论复方七芍降压片能够显著降低SHR大鼠血压,改善血管重塑,可能与调控肠系膜动脉中P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达,减轻炎症反应有关。

MEK抑制剂阻断小鼠脑缺血后ERK通路的激活和IL-1β mRNA合成

目的 研究细胞外信号调节激酶 (ERKs)在脑缺血中的作用以及U0 12 6对缺血脑组织保护作用的机制。方法 线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞 (MCAO)模型 ,颈内静脉注射U0 12 6 ;Westernblot法和免疫组化法检测 pMEK、pERK1/2和 pElk 1;核糖核酸酶保护测定法检测IL 1βmRNA含量。 结果 注射U0 12 6后的MCAO小鼠 pMEK活性降低 ,其降低幅度与U0 12 6有剂量依赖的关系 ,并在缺血前给药有效 ;U0 12 6注射后pERK1/2和 pElk 1也表现出相似的下降变化。小鼠MCAO后 1到 2hIL 1βmRNA水平上升 ;而注射U0 12 6后IL 1βmRNA在MCAO后 1至 4h内下降。 结论 ERK在小鼠脑缺血中发挥重要作用。静脉注射MEK抑制剂U0 12 6可阻断脑缺血引起的pMEK、pERK1/2和 pElk 1的活性增加。U0 12 6通过阻断ERK通路进而降低IL

Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中的表达及其意义

目的探讨Raf-1、MEK-2、ERK-1在胃癌组织中的表达形式及其意义,并分析此种信号途径与胃癌的临床病理特征之间是否存在联系,并为胃癌抗EGFR靶向治疗的分子标志物筛选提供依据。方法通过免疫组化中SP法检测60例胃癌患者标本胃癌组织和正常的胃组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达水平并进行比对。结果经统计60例胃癌组织当中Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达率分别为88.33%(53/60)、85.00%(51/60)、78.33%(47/60)。而正常的胃组织当中Raf-1、MEK-2、ERK-1均未见到阳性表达。被胃癌细胞转移的淋巴结组织中Raf-1、MEK-2、ERK-1的阳性表达率更为显著,分别高达95.12%(39/41),90.24%(37/41),87.80%(36/41)。未见癌细胞转移的淋巴结中Raf-1、MEK-2、ERK-1均无表达。实验证实Raf-1、MEK-2、ERK-1的表达水平与胃癌的临床特征中的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期有明显相关性(P<0.05)。结论 (1)人体胃癌组织当中存在Raf/MEK/ERK信号通路的激活;(2)人体胃癌组织中Raf/MEK/ERK信号通路的活化程度与胃癌组织的临床病理特征相关,此信号通路活化程度越高的胃癌组织,其分化的程度越低,TNM分期越高。三者联合检测可为研究胃癌的生物学行为乃至对靶向治疗胃癌提供十分重要的参考依据及指标。

千里光菲灵碱诱导MEK/ERK1/2介导的宫颈癌细胞自噬效应

探讨千里光菲灵碱对人宫颈癌He La、Caski细胞增殖、自噬的影响及其可能的作用机制。MTT法检测千里光菲灵碱对He La、Caski细胞增殖的影响;免疫荧光法检测GFP-LC3/He La和GFP-LC3/Caski两种细胞内自噬体的形成情况;免疫印迹法检测千里光菲灵碱对自噬相关蛋白表达的影响;荧光共定位法检测自噬体与溶酶体的融合情况;建立荷宫颈癌He La、Caski细胞移植瘤裸鼠模型,检测千里光菲灵碱对移植瘤生长的抑制作用。结果显示,千里光菲灵碱呈时间和剂量依赖性抑制He La、Caski两种宫颈癌细胞的增殖;千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞内自噬体的形成和LC3-II蛋白的增加及P62蛋白的减少,表明千里光菲灵碱可诱导He La、Caski细胞发生自噬;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬下游抑制剂氯喹(CQ)显著增加了LC3-II及P62的蛋白表达,同时荧光共定位显示千里光菲灵碱诱导的自噬体可与溶酶体实现共定位,表明千里光菲灵碱可诱导完整自噬流;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬上游抑制3-甲基腺嘌呤(3MA)剂显著增加了LC3-II的蛋白表达,显著降低了He La、Caski细胞的存活率,表明抑制自噬可增强千里光菲灵碱对宫颈癌细胞增殖的抑制作用;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合MEK抑制剂显著降低了P-ERK1/2的蛋白表达,减少了自噬体的形成,表明千里光菲灵碱诱导的He La、Caski细胞自噬依赖于MEK/ERK1/2途径;另外,千里光菲灵碱可显著抑制宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

MEK/ERK通路在高脂饮食诱导NAFLD大鼠SREBP-1表达中的作用

目的探讨MEK/ERK通路在高脂饮食诱导NAFLD大鼠固醇调控元件结合蛋白-1(SREBP-1)表达中的作用。方法应用高脂饮食复制大鼠非酒精性脂肪性肝病NAFLD模型。32只雄性Wister大鼠随机分成正常对照组(N组)、PD98059+普通饲料组(P组)、高脂模型组(M组)和PD98059+高脂组(PM组),每组8只。于分组喂养的第4、6、8周末分别给予P组和PM组大鼠鼠尾静脉注射MEK抑制剂PD98059干预。第10周末结束实验,检测血清丙氨酸转移酶(ALT)、门冬氨酸转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC),肝组织TG、TC;光镜观察大鼠肝脏的病理改变,免疫组化法检测肝脏磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和SREBP-1表达。结果与N组比较,M组所有大鼠肝细胞脂肪变性范围均超过30%并伴有不同程度的炎性细胞浸润和坏死,p-ERK1/2和SREBP-1表达增强,ALT、AST、TC、TG、肝组织TG、TC显著升高(P<0.01或0.05)。与M组比较,PM组p-ERK1/2和SREBP-1表达减少(P<0.01),ALT、TC、TG、肝组织TG、TC显著降低(P<0.01或0.05),同时大鼠的肝脏病理学得到了改善。结论 MEK/ERK通路在高脂饮食诱导NAFLD大鼠固醇调控元件结合蛋白-1(SREBP-1)表达中起重要作用。

平喘宁对哮喘大鼠肺组织MEK1、MEK2、Ras mRNA表达的影响

目的观察平喘宁对寒性哮喘大鼠气道形态学及肺组织中丝裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)1mRNA、MEK2mRNA及Ras mRNA表达水平的影响。方法将105只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,桂龙咳喘宁组,地塞米松组,平喘宁高、中、低剂量组,每组15只。以卵蛋白致敏及寒冷刺激复制大鼠哮喘模型,模型复制21d后,分别给予地塞米松组,桂龙咳喘宁组,平喘宁高、中、低剂量组大鼠相应药物灌胃,给予正常组和模型组大鼠等容量蒸馏水灌胃。4周后取出肺组织,采用苏木精-伊红染色行病理形态学观察,采用逆转录-聚合酶链式反应半定量检测MEK1mRNA、MEK2mRNA及Ras mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组发生明显炎性细胞浸润,气道平滑肌增厚;MEK1mRNA、MEK2mRNA以及Ras mRNA表达水平显著増高(P<0.05)。与模型组比较,地塞米松组、桂龙咳喘宁组、平喘宁组大鼠肺组织病理改变减轻;各治疗组MEK1mRNA、MEK2mRNA以及Ras mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论平喘宁可明显减轻哮喘大鼠的气道炎性反应,抑制哮喘大鼠肺组织中MEK1mRNA、MEK2mRNA以及Ras mRNA的表达,延缓气道重塑而治疗哮喘。

MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的:探讨MEK1/2在脂多糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECS)ICAM-1表达中的作用。方法:用不同浓度LPS或LPS加MEK1/2特异性抑制剂PD98059和HUVECS孵育不同时间后,分别采用RT-PCR和WESTERN BLOT- TING检测ICAM-1 MRNA和蛋白的表达。结果:LPS呈时间-浓度依赖性地上调HUVECS ICAM-1 MRNA和蛋白的表达。LPS预处理后2 H,HUVECS ICAM-1 MRNA和蛋白的表达即开始升高,LPS(100ΜG·L-1)作用后6 H,ICAM-1 MR- NA和蛋白的表达基本达到高峰;PD98059(10ΜG·L-1)可显著抑制LPS(100ΜG·L-1)诱导6 H的ICAM-1 MRNA和蛋白的表达,抑制率分别为54．4％和44．9％(P<0．01 VS LPS)。结论:调控MEK1/2通路可能为内毒素休克诱导血管内皮损伤的防治提供新的策略。

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.

MEK1在结直肠癌中表达及临床意义

目的:探讨有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导途径中MEK1表达与结直肠癌发生及淋巴结和肝转移的关系.方法:采用免疫组化方法,检测86例结直肠癌原发灶、正常结肠黏膜、转移淋巴结和肝转移灶MEK1表达.采用寿命表法分析对比MEK1表达对患者生存的影响.结果:大肠癌原发灶、正常结肠黏膜、转移淋巴结和肝转移灶中MEK1表达阳性率分别为:52.3%,32.6%,71.4%,78.3%.癌原发灶、肝转移灶和转移淋巴结中MEK1表达阳性率高于正常肠黏膜组织(P<0.01).按TNM分期,Ⅲ,Ⅳ期结直肠癌原发灶MEK1表达阳性率高于Ⅰ,Ⅱ期(P<0.01).低分化腺癌和黏液腺癌MEK1表达阳性率高于高-中分化腺癌(P<0.01).MEK1阳性组和MEK1阴性组的3a无病累积生存率分别为41.3%,73.1%.MEK1阳性组患者生存率低于MEK1阴性组,其差异有统计学意义(P<0.05).结论:MEK1增强表达与结直肠癌发生及淋巴结和肝转移有关,检测MEK1表达对判断结直肠癌患者预后有重要意义.

WNK2及MEK-1、ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义

目的探讨WNK2、MEK-1和ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学方法检测112例散发性结肠管状腺瘤伴不同程度异型增生及癌变组织中WNK2、MEK-1和ERK1/2在蛋白水平的表达情况。结果 WNK2蛋白在正常结肠黏膜、结肠管状腺瘤伴异型增生及腺瘤癌变组中阳性表达率逐渐降低(P<0.05),分别为100%、70%和42.86%,而MEK-1及ERK1/2蛋白阳性表达率明显升高,且异型增生组和癌变组中MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达率均明显高于正常结肠黏膜组(P<0.05)。WNK2蛋白的表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而降低,而MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而升高(P<0.05)。WNK2与MEK-1及与ERK1/2间存在负相关关系(r=-0.372,r=-0.371,P<0.05)。MEK-1与ERK1/2存在正相关关系(r=0.475,P<0.05)。结论 WNK2可能通过负向调节MEK-1及ERK1/2促进散发性结肠管状腺瘤的形成及癌变的发生。

MEK1表达载体的构建及其对肝癌细胞ERK通路活性的影响

目的构建pcDNA3.1(+)-MEK1真核表达载体,体外转染人肝癌MHCC97H细胞,观察MEK1在肝癌细胞中的表达及其对ERK通路活性的影响。方法应用RT-PCR扩增出MEK1基因插入pcDNA3.1(+)中,形成重组载体pcDNA3.1(+)-MEK1。经测序确认后,利用LipofectamineTM 2000将重组载体转染MHCC97H肝癌细胞,使用含G418的培养基进行筛选;将肝癌细胞分为不转染组、转染空载体组和转染重组载体组,运用Western-blot方法检测MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2在各组细胞中的表达并绘制各组细胞的生长曲线对比其增殖能力。结果重组载体pcDNA3.1(+)-MEK1酶切鉴定电泳条带大小正确,测序结果经Blast比对与人MEK1基因开放性读码框100%吻合;重组载体载体转染肝癌细胞后MEK1表达水平较不转染及转染空载体载体组细胞显著升高,且磷酸化的MEK1及ERK1/2水平也明显升高,转染重组载体载体的肝癌细胞增殖能力得到显著增强。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-MEK1,过表达MEK1蛋白可提高肝癌细胞MAPK/ERK通路活性。

Cyclosporin A通过MEK/ERK1/2信号通路调节滋养细胞titin表达

探讨MEK/ERK1/2信号通路在Cyclosporin A(CsA)诱导滋养细胞表达titin中的作用。应用RT-PCR、Western blot检测CsA诱导的滋养细胞titin的表达水平,Western blot检测CsA作用于滋养细胞后ERK1/2的活化程度,并观察MEK特异性抑制剂U0126对其mRNA转录的影响。发现CsA以时间和剂量依赖方式诱导titin表达,并刺激滋养细胞ERK1/2的活化,U0126以剂量依赖方式抑制CsA诱导的titin表达。结果表明CsA通过活化MEK/ERK1/2信号通路诱导滋养细胞titin 的表达,改变其生物学行为,从而有利于胚胎着床及早期发育。

营心宁胶囊通过MEK1调控肝X受体促进动脉粥样硬化斑块稳定与消退的机制

目的:探讨营心宁胶囊通过MEK1调控肝X受体促进动脉粥样硬化斑块稳定与消退的机制。方法:以雌性C57BL/6小鼠为研究对象,以营心宁胶囊作为丝氨酸-苏氨酸激酶MEK1/2抑制剂,将小鼠分为空白对照组,模型组,营心宁胶囊低、中、高剂量组。分别对小鼠肝脏、脾脏、肾脏、小肠和淋巴结,进行切片固定,对其血清进行生化分析;通过油红O染色对全动脉进行观察。以ApoE-/-小鼠构建胆固醇反向转运分析及动脉粥样硬化斑块分析。结果:与模型组比较,营心宁胶囊高剂量组血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)和谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,AST)含量下降(P<0.05);随着营心宁胶囊浓度的增加,肝脏脂质积聚量明显减少;与空白对照组比较,模型组及营心宁胶囊低剂量组LXR mRNA表达量降低(P<0.05),营心宁胶囊中、高剂量组LXR mRNA表达量与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。用药组ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积及主动脉根部斑块面积比均下降且降低了TG在肝脏中的积累量。结论:营心宁胶囊对肝X受体动脉粥样硬化斑块稳定与消退具有促进作用。

M3受体通过激活MEK1/2-ERK1/2信号通路促进H9c2心肌细胞生存

目的研究毒蕈碱型胆碱受体(M受体)对H9c2心肌细胞MEK1/2-ERK1/2信号通路的调控作用及其对细胞活力的影响。方法 H9c2心肌细胞用非选择性或选择性M受体拮抗药处理30 min之后,以氨甲酰胆碱刺激细胞,然后用Western Blot检测全细胞蛋白质中MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平的变化,采用Alamar Blue法检测细胞活力。结果以氨甲酰胆碱刺激H9c2心肌细胞能显著增加MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平,这种活化作用可被非选择性M受体拮抗药阿托品完全阻断;M3受体选择性拮抗药DAU 5884可以阻断氨甲酰胆碱对MEK1/2-ERK1/2的激活,但M1、M2和M4受体的选择性拮抗药则没有这种阻断作用;在无血清的培养基中,氨甲酰胆碱能增加H9c2心肌细胞的生存能力,这种细胞保护作用可被阿托品和DAU 5884消除。结论在H9c2心肌细胞中,氨甲酰胆碱通过M3受体调控MEK1/2-ERK1/2信号通路,并由此促进细胞的生存。