MES23.5细胞酪氨酸羟化酶的种属来源及其重组酶的活性测定

MES 2 3 5细胞作为研究神经变性疾病的工具 ,是一种杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系 ,由大鼠胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤 胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成 .其酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase ,TH)的动物种属来源不清楚 .应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)法从MES 2 3 5细胞系中克隆了编码TH的cDNA ;结构分析表明 ,其cDNA编码区由 14 97碱基构成 ,共编码 4 98个氨基酸 ,与大鼠和小鼠TH的同源程度分别为 93%和 10 0 % .该杂交瘤细胞系表达小鼠TH .将该cDNA亚克隆至原核表达载体pGEX 4T 1,经原核细胞表达、亲和层析得到了电泳纯的基因重组小鼠TH(recombinantmousetyrosinehydroxylase ,rmTH) .改良和建立了一种体外分析TH活性的新方法 .活性分析证明 ,纯化的rmTH能催化L 酪氨酸发生加单氧反应生成L 3,4 二羟基苯丙氨酸 (L 多巴 ) .rmTH的表观分子量为 5 6kD ;其酶促加单氧反应的最适pH值为 7 0 .乙二胺四乙酸能显著抑制此酶的活性 ,而亚铁离子能明显增强其活性 .

迷迭香酸对MPP^+导致MES 23.5细胞损伤保护作用

目的观察迷迭香酸对1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)所致MES 23.5细胞损伤的保护作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测方法,观察不同浓度的迷迭香酸对MPP+处理的MES 23.5细胞的保护作用。结果 10-9~10-6mol/L的迷迭香酸对MES 23.5细胞无毒性作用(F=0.581,P>0.05)。200μmol/L的MPP+可使细胞存活率降低(F=44.863,P<0.01),而应用10-9~10-6mol/L的迷迭香酸预孵育细胞后,能明显提高细胞的存活率(P<0.01)。结论迷迭香酸能拮抗MPP+对MES 23.5细胞的毒性作用,具有一定的神经保护作用。

淫羊藿总黄酮对MPP^+诱导MES23.5细胞损伤保护作用

目的探讨淫羊藿总黄酮对1-甲基-4-苯吡啶离子(MPP+)诱导的MES23.5细胞损伤的保护作用。方法 MES23.5细胞常规培养,淫羊藿总黄酮预处理24 h,再用MPP+和淫羊藿总黄酮共同处理细胞24 h,MTT法检测细胞的存活率,实时反转录聚合酶链反应(real ti me RT-PCR)观察bcl-2和bax基因的表达情况。结果 MPP+可剂量依赖性地损伤MES23.5细胞(F=18.38,P<0.001);淫羊藿总黄酮预处理可明显对抗MPP+的毒性作用(F=44.36,P<0.001);MPP+对bcl-2基因表达没有明显影响,但可明显增加bax基因的表达(F=10.92,P<0.05);淫羊藿总黄酮预处理可明显增加bcl-2基因的表达(F=15.76,P<0.01),并可逆转bax基因表达的增高(F=10.92,P<0.05)。结论淫羊藿总黄酮可明显对抗MPP+对MES23.5神经细胞的损伤,其作用机制可能与抗凋亡有关。

1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导MES 23.5细胞线粒体功能异常的实验研究

目的 探讨 1 -甲基 -4 -苯基吡啶离子 (MPP+ )诱导多巴胺 (DA)能神经元死亡的线粒体功能异常机制。方法 不同浓度的 1 -甲基 -4 -苯基 -1 ,2 ,3 ,6-四氢吡啶 (MPTP)、MPP+ 及还原型谷胱甘肽 (GSH)与 MES2 3 .5细胞共同培养 ,采用 MTT比色法及流式细胞术检测细胞线粒体膜电势 (△ Ψ m)和氧自由基 (ROS)的变化。结果 MES2 3 .5细胞活力在 MPP+组显著减低 ,且与浓度呈正相关 ,GSH+MPP+组轻度减低 ,而 MPTP组不降低。此外 ,用 MPP+ 处理后 MES 2 3 .5细胞线粒体 △ Ψ m明显下降和 ROS生成显著增加。结论 线粒体△ Ψ m下降及ROS生成增多可能参与了 MPP+ 诱导黑质

氧化应激诱导多巴胺能MES23.5细胞α-突触核蛋白C-末端片段核转位

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)和氧化应激的相互作用关系。方法用200μmol/LH2O2处理多巴胺能MES23·5神经细胞作为氧化应激的细胞模型。采用免疫荧光、硫磺素S组织化学染色和免疫印迹技术检测细胞氧化应激反应中α-突触核蛋白的表达状态和亚细胞定位。结果200μmol/LH2O2处理可诱导α-突触核蛋白从细胞浆转位到细胞核内,而且转位到细胞核内的是约10kD的α-突触核蛋白C-末端片段,而存在于细胞浆内的是完整的α-突触核蛋白。硫磺素S染色显示,转位到细胞核内的α-突触核蛋白C-末端片段呈非聚集状态。结论氧化应激可诱导多巴胺能MES23·5神经细胞α-突触核蛋白C末端约10kD的片段核转位。

Eya1基因S298A突变型过表达慢病毒载体的构建及其对MES23.5细胞凋亡的影响

目的构建小鼠Eya1第298位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)的慢病毒表达载体,并探讨Eya1的298位点突变对MES23.5多巴胺能细胞凋亡的影响。方法采用PCR法、Golden Gate技术和LR反应构建携带Eya1S298A基因的慢病毒重组表达质粒。嘌呤霉素筛选稳定表达Eya1S298A的MES23.5细胞株。将稳定表达Eya1S298A或Eya1的MES23.5细胞经6-羟多巴胺处理2h,构建细胞损伤模型。CCK8法和Western blot法检测298位点突变对细胞活力和Bcl-2蛋白表达的影响。结果测序结果和PCR结果表明Eya1基因的第298位S被突变为A,Eya1S298A基因成功连接于慢病毒载体。CCK8结果表明,Eya1S298A突变组的细胞活力水平明显低于Eya1野生组(P<0.05)。Western blot结果表明,突变组Bcl-2蛋白表达水平明显低于野生组(P<0.05)。结论成功构建含Eya1S298A基因的慢病毒表达质粒,并建立稳定表达Eya1S298A的细胞株;Eya1的298位点突变降低了Eya1对MES23.5细胞的抗凋亡作用。

Eya1基因过表达对MES23.5细胞凋亡的影响

目的构建眼发育缺失1(Eya1)基因慢病毒载体,并探讨过表达Eya1对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的鼠多巴胺能神经元细胞MES23.5凋亡的影响。方法构建过表达Eya1基因的慢病毒,并感染MES23.5细胞,筛选稳定表达Eya1的细胞株;6-OHDA药物处理诱导MES23.5多巴胺能细胞损伤模型,分为对照组、空载体组、过表达Eya1组;采用CCK-8法检测细胞活力、细胞凋亡Hoechst染色(Hoechst 33258)和Western blot检测过表达Eya1对细胞凋亡的影响。结果酶切电泳显示目的基因重组至慢病毒载体,测序结果表明构建的Eya1基因过表达载体与Eya1基因编码序列完全一致;CCK-8显示6-OHDA药物处理后过表达Eya1组的细胞活力水平高于对照组(P<0.05);Hoechst 33258染色显示过表达Eya1组的细胞核浓缩聚集水平低于对照组;且过表达Eya1组中Bcl-2蛋白的表达高于对照组(P<0.05),Bax蛋白的表达低于对照组(P<0.05)。结论成功构建了过表达Eya1的MES23.5细胞株,Eya1通过调控Bcl-2、Bax蛋白表达,从而拮抗6-OHDA诱导的MES23.5多巴胺能细胞的凋亡。

光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

PEDF对肺鳞状细胞癌SK-MES-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的:探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对肺鳞状细胞癌(鳞癌)SK-MES-1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,阐明PEDF与肺鳞癌发生发展的关系。方法:培养SK-MES-1细胞,设不加PEDF的细胞为阴性对照组,PEDF干预组细胞分别加入180、360和720nmol·L-1 PEDF;MTT法检测各组SK-MES-1细胞增殖抑制率,细胞侵袭实验测定阴性对照组和720nmol·L-1 PEDF干预组SK-MES-1细胞穿透数,倒置显微镜观察各组SK-MES-1细胞形态学,流式细胞术检测各组SK-MES-1细胞凋亡率。结果:PEDF干预组细胞增殖抑制率均显著高于阴性对照组(P<0.01),不同剂量PEDF干预组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组细胞贴壁生长良好,PEDF干预组细胞排列逐渐稀疏,形态改变明显。720nmol·L-1 PEDF干预组SK-MES-1细胞穿透数(31.6±15.8)低于阴性对照组(75.4±19.3),差异有统计学意义(P<0.01)。随着PEDF干预剂量增加,细胞凋亡率逐渐升高,不同剂量PEDF干预组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:PEDF抑制SK-MES-1细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡,对肺鳞癌生长和转移发挥对抗效应。提示PEDF可能成为肺鳞癌患者预后判定、抗癌治疗的有效因子。

回药爱康方含药血清对人肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖及周期的影响

目的探讨回药爱康方(AKF)含药血清对人肺鳞癌SK-MES-1细胞增殖及周期的影响。方法雄性SD大鼠80只,按体重随机分为8组:生理盐水对照组(NS),回药爱康方低、中、高剂量(AKFL、AKFM、AKFH)组,环磷酰胺(CTX)组,AKFL、AKFM、AKFH联合CTX组。分别给予相应AKFL、AKFM、AKFH浓缩水煎剂灌胃,连续5d;CTX组和联合组再按20mg·kg-1给予环磷酰胺于第1、3、5天腹腔注射。NS组给予等量生理盐水。上述各组动物取血制备含药血清,体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞。应用MTT法检测各组含药血清对SK细胞增殖的影响,流式细胞仪进行细胞周期时相分析。结果 AKF含药血清作用不同时间对SKMES-1细胞生长有抑制作用(P<0.05)。AKF联合CTX含药血清能够抑制SK细胞增殖,其中AKFH联合CTX组的抑制率明显高于其他组,48h之内抑制程度呈时间和浓度依赖性。5%、10%、20%浓度组的含药血清作用SK-MES-1细胞24、48、72h后,与NS比较,除AKFL外,其余各组抑制率均有升高(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,AKF含药血清及联合CTX含药血清能使SK细胞阻滞于G1期,随着药物浓度的增加,G1期细胞增多、S期细胞减少,和NS组比较,高剂量以及联合组尤为明显(P<0.05)。10%、20%浓度含药血清组与NS组比较,各组的G0/G1期细胞增多、S期细胞逐渐减少(P<0.05);而与CTX组比较,G0/G1期细胞少于CTX组,S期细胞多于CTX组(P<0.05),各联合组G0/G1期细胞多于CTX组,S期细胞少于CTX组(P<0.05)。结论 AKF含药血清可抑制SK细胞增殖,并与CTX有协同作用,其机制可能与其阻滞细胞于G1期有关。

尿激酶型纤溶酶原激活因子调控人头颈部鳞状细胞癌转移的功能与机制研究

目的 探究尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)在头颈部鳞状细胞癌中的表达以及转移中的作用,并对其相关分子机制进行研究。方法 实验室培养人咽鳞癌细胞株FaDu细胞与人喉癌细胞株TU686细胞;使用siRNA靶向敲减/过表达PLAU基因后,利用qRT-PCR和Western Blot实验验证转染效率;Transwell与细胞划痕实验检测肿瘤细胞的侵袭、迁移能力变化情况;检测N-钙黏蛋白、锌指转录蛋白、波形蛋白在HNSCC细胞中表达的情况,分析其表达与PLAU对肿瘤远处转移的相关性。结果 PLAU在HNSCC中高表达,组间差异有统计学意义(P<0.05),且晚期或复发转移性HNSCC中的PLAU明显高表达于早期或原位癌。过表达PLAU有促进喉癌细胞转移的能力,PLAU可能调控N-钙黏蛋白、锌指转录蛋白、波形蛋白等诱导头颈部肿瘤的转移组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PLAU可能是通过细胞-间充质转化过程促进HNSCC的迁移和侵袭。

miR-181a-5p在ACS患者血清中表达及对人HCASMC细胞增殖迁移的调控作用、与ADAMTS1靶向关系

目的观察微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清中的表达及对人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC)增殖和迁移的调控作用,探讨miR-181a-5p与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶1(ADAMTS1)的靶向关系。方法采集100例ACS患者[ACS组,其中急性心肌梗死(AMI)患者55例、不稳定心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)患者44例]、40例冠脉造影结果阴性者(对照组)的外周静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测两组血清miR-181a-5p。取对数生长期HCASMC细胞,分为一、二、三、四组,采用脂质体转染法分别转染miR-181a-5p模拟物(miR-181a-5p mimics)、模拟物阴性对照(mimics-NC)、miR-181a-5p抑制物(miR-181a-5p inhibitor)及抑制物阴性对照(inhibitor-NC),培养48 h时采用CCK-8法测算细胞增殖能力、采用Transwell迁移实验测算细胞迁移能力,培养24 h时采用采用Western Blotting法检测各组细胞ADAMTS1蛋白。取对数生长期HCASMC细胞分为A、B、C、D四组,A组先后转染突变型ADAMTS1荧光素酶报告基因质粒(ADAMTS1-MUT)、miR-181a-5p mimics;B组先后转染ADAMTS1-MUT、mimics-NC;C组先后转染野生型ADAMTS1荧光素酶报告基因质粒(ADAMTS1-WT)、miR-181a-5p mimics;D组先后转染ADAMTS1-WT、mimics-NC,培养24 h时取各组细胞采用双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞相对荧光素酶活性。结果与对照组相比,ACS组患者血清miR-181a-5p相对表达量低(P<0.01);与UAP患者相比,AMI患者血清miR-181a-5p相对表达量低(P<0.01)。与二组相比,培养48 h时一组细胞增殖能力和迁移能力降低,培养24 h时一组细胞ADAMTS1蛋白相对表达量低(P均<0.01);与四组相比,培养48 h时三组细胞增殖能力和迁移能力高,培养24 h时三组细胞ADAMTS1蛋白相对表达量高(P均<0.01)。A、B、C、D组细胞荧光素酶活性分别为1.03±0.03、1.01±0.04、0.45±0.06、1.02±0.05;与B组相比,A组细胞荧光素酶活性明显低(P<0.05)。结论miR-181a-5p在ACS患者血清中低表达。miR-181a-5p可抑制HCASMC细胞的增殖、迁移,其机制可能为miR-181a-5p靶向促进细胞ADAMTS1蛋白表达。

面向柴油机制造企业基于MES的车间单元调度探究

针对柴油机制造企业产品结构复杂、加工制造周期长、设备利用率低以及生产过程中人为调度密集,底层信息不能及时反馈等现状,提出了面向柴油机制造企业基于MES的车间单元调度系统。首先分析了系统的体系结构,调度流程以及实现功能,在此基础上建立了车间单元调度的多目标模型,并进一步采用基于TOC的遗传-分散搜索混合算法进行求解,使车间单元调度系统更具科学性和实用性。

面向柴油机制造企业基于MES的车间单元调度探究

针对柴油机制造企业产品结构复杂、加工制造周期长、设备利用率低以及生产过程中人为调度密集，底层信息不能及时反馈等现状，提出了面向柴油机制造企业基于MEs的车间单元调度系统。首先分析了系统的体系结构，调度流程以及实现功能，在此基础上建立了车间单元调度的多目标模型，并进一步采用基于TOC的遗传一分散搜索混合算法进行求解，使车间单元调度系统更具科学性和实用性。

苦参碱诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞凋亡作用及其可能机制

目的:探讨苦参碱(MT)诱导人肺鳞癌细胞株SK-MES-1凋亡作用及其抗肿瘤机制。方法:培养人肺鳞癌细胞株SK-MES-1,用不同浓度的MT处理SK-MES-1细胞,用MTT法检测MT对SK-MES-1细胞生长增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期;流式细胞术检测细胞相关凋亡蛋白Bcl-2、bax、caspase-3表达。结果:MT抑制SK-MES-1细胞增殖和诱导SK-MES-1细胞的凋亡作用均呈剂量和时间依赖性。与对照组相比,苦参碱处理后的SK-MES-1细胞G0/G1期百分比明显增高,S期细胞比例下降。Bax和capase-3表达增强,Bcl-2表达下调。结论:MT在体外能抑制人肺鳞癌细胞株SK-MES-1增殖,诱导细胞凋亡,其诱导作用具有明显的量效和时效关系,可能与抑制Bcl-2活性、激活bax和capase-3有关。

应用MES系统对工厂进行整体优化的研究

计算机技术的不断发展使得企业信息化管理的水平得到稳步提升。MES(制造执行系统)在企业中的运用能够有效地提高企业的核心竞争力,向发达国家的信息管理技术靠拢。本文将以太阳能电池制造企业为例,讲述MES系统的运用对企业生产的整体优化过程。

基于OPC UA的氢燃料电池MES系统的研究与设计

针对氢燃料电池生产车间现场底层工业设备之间异构数据较多,系统难以实现互联,数据信息难以互通的情况,设计了一种基于OPC UA的氢燃料电池MES系统。系统采用OPC UA的地址空间和信息模型描述工业设备模型,实现数据采集,通过C/S架构搭建系统框架,确保数据安全可靠,且具有一定的平台独立性和可扩展性,可打通与上层的ERP等第三方系统、与底层的工业设备之间的信息链,有效提高生产效率和氢燃料电池质量,实现氢燃料电池生产制造过程的追溯管理。与现场设备连接测试,系统运行良好。

晶体硅太阳电池生产中的ERP系统及MES搭建

针对当前晶体硅太阳电池生产企业中企业资源计划(Enterprise Resource Planning,ERP)系统与制造执行系统(Manufactory Execution System,MES)不能形成有效契合,企业生产制造业务与资源配置、财务核算存在脱节的问题,通过创新性地以“以产定销”模式搭建业务主流程,匹配清晰的业务站点设计,成功实现了ERP系统与MES无缝对接的数字化运营系统搭建。

面向光伏电池数字化车间的MES系统设计

为改善光伏制造业生产过程中依赖人工生产和管理的现状,引入MES(生产执行系统)对车间进行数字化改造,实现了光伏电池生产的自动化管理以及过程可追溯,降本增效的同时也为企业管理者提供有价值的决策支持信息。