基于TaqMan MGB探针的大豆北方茎溃疡病菌快速检测

为准确快速检测检疫性真菌大豆北方茎溃疡病菌,根据大豆北方茎溃疡病菌及其近似种的模式分离物ITS序列差异,设计并合成1对特异性引物和1条MGB探针,建立大豆北方茎溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明:该检测方法能特异性检测大豆北方茎溃疡病菌。灵敏度试验结果表明:最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量1.0 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.5μmol·L^(-1),探针终浓度0.6μmol·L^(-1)。实际样品检测结果表明:该方法可用于疑似受大豆北方茎溃疡病菌侵染的进境大豆样品的检测与初筛。此方法准确、快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,可作为大豆北方茎溃疡病菌检测防控方法。

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。

应用TaqMan MGB探针检测小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌

以小麦印度腥黑穗病菌9个菌株和黑麦草腥黑穗病菌5个菌株及其近似种或相关种:稻粒黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、狗尾草腥黑粉菌、苏玛特腥黑粉菌、狐尾草腥黑粉菌、小麦网腥黑穗病菌和小麦矮化腥黑穗病菌共9种22个菌株为研究对象,通过序列比对分析,设计了检测小麦印度腥黑穗病菌及黑麦草腥黑穗病菌的TaqM an MGB实时荧光PCR引物和探针,优化了反应条件,筛选出特异性探针,分别建立了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑穗病菌实时荧光单重PCR和实时荧光双重PCR检测方法,其中实时荧光双重PCR检测方法实现了在同一PCR管中仅用5μL的反应体系,进行1次PCR反应就能特异性检测出小麦印度腥黑穗病菌或黑麦草腥黑穗病菌。本研究所建立的检测方法特异性强、结果可靠、检测速度快、成本明显降低,在实际应用中具有推广价值。

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒

目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的最低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.

TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒

应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。

TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究

利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆(Roundup ReadyTM)的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup ReadyTM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r2:0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。

黏菌素耐药基因mcr-1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。【方法】针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针,构建重组质粒作为阳性标准品,优化引物、探针浓度及Rox参比染料用量、退火温度等反应条件,建立针对mcr-1基因的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】Taq Man-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00μL:Premix Ex Taq^(TM)10.00μL,Rox参比染料(50×)0.25μL,引物MCR-1F/MCR-1R(10μmol/L)各0.50μL,MCR-1-P探针(10μmol/L)0.50μL,重组质粒pMCR-1(模板)2.00μL,灭菌双蒸水6.25μL。扩增程序:95℃预变性20 s;95℃10 s,60℃20 s,进行40个循环。该检测方法能特异性扩增出mcr-1基因,其检测敏感性为2.85拷贝/μL,是常规PCR的100倍,组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%~1.18%,均小于1.20%。采用建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果未发现有携带mcr-1基因的菌株。【结论】针对mcr-1基因建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于临床筛查mcr-1基因,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持。

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。

大口黑鲈溃疡综合征病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据大口黑鲈溃疡综合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus,LBUSV）的甲基转移酶（MTase）基因核苷酸序列设计引物及TaqMan-MGB探针,优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,建立了LBUSV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法.用含有MTase基因的质粒pDNA-MT系列稀释作为标准品模板,在荧光定量PCR仪上进行PCR反应,绘制标准曲线,斜率为-3.24,R2=0.999,呈现很好的线性关系,扩增效率1.04.灵敏度检测结果表明,PCR反应24个循环时可以检测到的质粒最小浓度是102拷贝数/μL.选用107、106、105、104拷贝数/μL 4个浓度梯度质粒做模板,变异系数在1.1%-3.4%范围内,说明该方法具有良好的重复性和稳定性.利用该方法可以准确地检测出感染LBUSV的病鱼,特异性强.

应用TaqMan-MGB探针FQ-PCR探讨鸭瘟弱毒苗在鸭体内的分布及排泄规律

用鸭瘟病毒(DPV)Cha株弱毒苗皮下注射免疫20日龄樱桃谷鸭,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对免疫后10、30、609、0 min及12、24 h和6、9、12、21、366、0 d鸭的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、回盲处、血液、气管、气管分泌液、食管及其分泌液、十二指肠、空肠、回肠、肓肠、直肠及各肠段分泌液中DPV-DNA的拷贝数(以对数值表示)进行了检测。结果显示,免疫后10 min即可在胸腺和血液中检测到DPV-DNA;60 min肾脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.349);脾(9.932)、脑(9.791)、胸腺(9.736)、法氏囊(9.598)及哈德氏腺(8.135)中DPV-DNA拷贝数于90 min分别达到最高;12 h后所有受检样品中都能检测到DPV-DNA,其中心脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.818);肠道中DPV-DNA拷贝数在免疫后6~12 d明显高于其他组织,其中盲肠是DPV-DNA拷贝数(10.591)最高的受检样品,直肠分泌液中DPV-DNA最早于90 min检测到。研究表明,免疫鸭于免疫早期在包括主要免疫器官在内的各实质...

Taq Man MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

目的初步研究TaqManMGB探针实时聚合酶链反应(TaqManMGBRealtimePCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Denguevirus,DV)鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqManMGBPCR检测,根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只/500μl和3只/1000μl,一步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqManMGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqManMGBRealtimePCR最好采用二步法。

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针，两条探针5’端分别标记FAM和HEX，3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系，并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测，验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性（LP12、LP13除外）；嗜肺军团菌均为mip阳性，非嗜肺军团菌属除L．micdadei外均为阴性；而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝／反应；重复性实验中，变异系数为0．2％～O．6％；从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法，可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属，该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估，以及应急临床标本的快速定量检测。

检测小麦线条花叶病毒的TaqMan MGB探针技术

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与Taq Man MGB荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本研究设计的Taq Man MGB荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难。该方法无需任何PCR后处理,基因污染风险小。它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测。

一步法MGB荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法的建立

目的为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。方法本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,设计引物和MGB探针,通过优化反应条件,建立了一种检测EBOV扎伊尔亚型和苏丹亚型的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法。结果以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×103个拷贝/μL,检测范围达到8个数量级为103～1010。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。结论本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV扎伊尔亚型和苏丹亚型荧光定量RT-PCR检测方法,具有一定的创新性。该方法的建立对加快我国EBOV诊断技术的研究具有重要推动作用。

牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据IBRVgB基因保守区域设计特异性引物和MGB探针,并采用矩阵法优化了PCR反应条件。结果显示,标准曲线相关系数(R2)为0.998,103拷贝/μL^108拷贝/μL内具有较好的线性关系。对牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻粘膜病1型、牛副流感病毒3型的cDNA进行检测,结果均为阴性,特异性良好。该方法对IBRV检测的灵敏度可达到1.49×101拷贝/μL,是常规PCR灵敏度的100倍,重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%。应用建立的方法与普通PCR方法分别对17份疑似临床呼吸道症状牛鼻黏液拭子样品进行检测,该方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了约12%。研究表明建立的IBRV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于临床疑似样品的快速定量检测。

一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明：该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）、经典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照（PCR2．1-ASFV—CP530R）的线性范围为6．1×10^2-6．1×10^9copies／μL，标准曲线方程为Y=-3．449x＋38．10，相关系数（R^2）为0．999，最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子；对5个不同浓度（6．1×10^3-6．1×10^7copies／μL）的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测，每个浓度质粒标准对照的D值变异系数均小于2．0％，具有良好的重现性；用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。

鹦鹉热嗜性衣原体特异性TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和MGB探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价与Spike-test实验进行临床应用性评价,利用该检测方法对禽鸟类粪便样品进行检测,并与常规PCR检测方法进行比较。结果该方法在0.01pg^100pg范围内线性相关系数为0.999,扩增效率为97.7%;对鹦鹉热嗜性衣原体菌株检测结果均呈现阳性,而非鹦鹉热嗜性衣原体菌株及其它衣原体菌株为阴性;重复性试验中,变异系数为0.317%~0.563%;检测灵敏性为0.01pg;Spike-test试验中最低检出量为25个EB;该方法对禽鸟类粪便样品的检出率为14.3%(40/282),高于常规PCR检测法的7.4%(21/282)。结论本文所建立的Taqman-MGB荧光定量PCR检测法是一种灵敏、高效、稳定,可在嗜性衣原体属中准确检测鹦鹉热嗜性衣原体的方法,该方法的建立更有意于今后对禽鸟类实施鹦鹉热的临床诊断与分子流行病学研究。

超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。

Taqman MGB探针快速定量检测VHSV方法的研究

为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了Taqman MGB探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PCR方法),并与世界动物卫生组织(OIE)推荐的普通RT-PCR法进行了比较。此荧光RT-PCR法特异性好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。检测线性范围为10^(10)～10~2拷贝/反应,灵法度达10~2拷贝/反应。此检测灵敏度比OIE推举的RT-PCR法高出5个数量级,比嵌套RT-PCR高出1个数量级。此法是出入境检疫VHSV的有效方法。