乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白．方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达．后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5α),并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析．结果:应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到7种已知基因,分别为ADP核糖基因子2种,RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4- NOT-10)1种,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种,醛缩酶B(ALDOB)1种,补体成分3(C3)1种,丙酮酸脱氢酶(PDH)1种．结论:成功克隆出MHBst结合蛋白．

乙肝病毒截短型中蛋白反式调节作用的研究进展

HBV编码的反式激活蛋白可能是HBV致癌的主要因素之一。研究证实乙型肝炎病毒表面抗原羧基末端截短型中蛋白(MHBst)是一种具有反式激活作用的蛋白质分子,可调节原癌基因、端粒酶及一氧化氮合酶的表达,影响磷脂代谢并与胰岛素抵抗相关。现就MHBst的研究进展进行综述。

HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^(t78)MHBs^(t155)真核重组载体构建

目的分别构建人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白、羧基端截断的中分子表面蛋白MHBst78、MHBst155编码基因的真核重组表达载体,以便进一步研究其转录激活功能及对宿主细胞信号传导通路的影响。方法设计合成3对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBVX基因、MHBst78与MHBst155编码基因片段;用HindⅢ,KpnⅠ双酶切HBVⅩ基因;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切MHBst78与MHBst155编码基因片段后,分别定向插入到真核表达载体pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切重组体显示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBVX基因、羧基端截断的HBV中分子表面蛋白MHBst78、MHBst155编码基因的真核重组表达载体,为进一步研究HBV转录激活蛋白HBx、MHBst78MHBst155对宿主细胞信号转导通路的影响奠定基础。

HBx、MHBs^(t155)真核表达载体构建及在HepG2细胞中的表达

目的建立稳定、高效的HBx、羧基末端截短的中分子表面蛋白(MHBst)体外表达细胞株,以进一步研究HBx、MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及其机理。方法设计特异性引物,采用PCR方法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBx、羧基末端截短至155位氨基酸的中分子表面蛋白(MHBst155)编码基因,并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-C1的BglⅡ、KpnⅠ和BglⅡ、BamHⅠ酶切位点,转化宿主菌DH5α,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。采用脂质体介导将空载体、重组质粒分别转染到人肝肿瘤细胞株HepG2中,G418筛选抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR、蛋白印迹检测抗性细胞中HBx、MHBst155的mRNA及蛋白水平。结果经酶切及测序鉴定成功构建了pGFP-HBx、pGFP-MHBst155重组表达载体,将空载体及重组质粒转染HepG2,经G418筛选约20 d获得抗性细胞克隆。将带有绿色荧光的抗性克隆扩大培养并经传代40次,细胞仍表达强的绿色荧光。RT-PCR及蛋白印迹检测表明转染重组体的HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-MHBst155细胞有相应的条带,而空载体、空白对照组未出现条带。结论成功构建了HBx、MHBst155真核重组表达载体pGFP-HBx、pGFP-MHBst155,获得了稳定表达融合蛋白GFP-HBx、GFP-MHBst155的HepG2细胞系,为进一步研究HBx及MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及分子机制构建了良好的平台。