猪MHC-DQB、DRB近端调控区序列及其多态性

根据人MHC-DRB和MHC-DQB基因组序列和猪MHC-DRB和MHC-DQB基因外显子1设计引物,应 用PCR扩增及克隆测序技术,首次得到了猪MHC-DRB和MHC-DQB基因的5'上游近端调控区(URR)序列。分 析发现所得序列中存在与MHCⅡ类基因表达调控有关的高度保守的W、X、Y、CCAAT及类TATA调控元件,调控 元件的空间组织顺序也与其他物种相应序列的相同。利用SSCP技术在313头猪中共发现12个DRB-URR复等 位基因和14个DQB-URR复等位基因,序列比对结果表明在这些复等位基因中存在丰富的多态位点,为进一步深 入研究猪MHCⅡ类基因近端调控区的多态性及抗病育种研究奠定了基础。

多浪羊MHC-DRB1基因多态性与包虫病抗性分析

通过PCR扩增122只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和70只包虫病阳性多浪羊的MHC-DRB1第2外显子,产物经SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ3种限制性内切酶酶切后进行RFLP多态性分析。结果表明,多浪羊MHC-DRB1基因第2外显子在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切位点存在丰富的多态性,分别检测出了2、2和6种等位基因,出现了3、3和18种基因型。将包虫病阴性和阳性多浪羊的等位基因频率和基因型频率分别进行比较分析,发现等位基因HaeⅢa对包虫病感染具有一定的易感性(P<0.05),SacⅠab和Hin1Ⅰaa 2个基因型对包虫病具有一定的抗性(P<0.05),HaeⅢbe和HaeⅢef这2个基因型对包虫病具有较强的易感性(P<0.01)。

中国美利奴羊MHC-DRB_1基因PCR-RFLP多态性分析

应用巢式PCR-RFLP方法,对211只中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1外显子2的遗传多态性进行检测,并对基因型频率和等位基因频率进行了统计,结果表明,中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1基因外显子2在SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ的酶切位点存在多态性,这些酶切位点分别受2、2和6个等位基因控制,由于MHC-DRB1为多碱基突变的基因位点,综合3种限制性内切酶的酶切结果,在中国美利奴(新疆军垦型)羊中共发现24种等位基因;χ2适合性检验结果表明,中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1外显子2在SacⅠ和Hin1Ⅰ酶切位点均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),但在HaeⅢ酶切位点未达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

中国云南地区恒河猴群MHC-DRB部分等位基因的调查

目的了解云南地区恒河猴MHC—DRB部分基因的分布情况。方法采用序列特异性引物-聚合酶链式反应（PCR—SSP）分型方法对云南地区4个恒河猴群进行MHC～DRB部分基因检测，用1．5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将有目的片段的部分样品进行测序。结果宁蒗恒河猴群检测出了12个基因，检出率为3．85％-57．69％；昆明自繁恒河猴群检测出了11个基因，检出率为1．63％-42．28％；景东恒河猴群检测出了10个基因，检出率为3．70％～33．33％；镇沅恒河猴群检测出了9个基因，检出率为5．26％-63．16％。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列与GenBank数据库中的序列同源性为92％～99％。卡方检验结果表明，除了MHC—DRB W201基因外（P〈0．05），其余各基因在云南4个恒河猴群体之间的携带率均不存在统计学差异（P〉0．05）。结论云南地区恒河猴12个MHC—DRB基因均存在阳性个体，为今后开展具有特定DRB基因的恒河猴群筛选和选育提供了基础，为生物医学相关研究提供合适的具有特定遗传背景的实验动物提供依据。

中华菊头蝠MHC Ⅱ-DRB基因遗传多态性及进化

采样自云南同一种群的中华菊头蝠共16个个体,用于DRB基因的分子进化和多态性研究。利用翼膜组织提取DNA基因组,并PCR克隆测序分析。获得了相差3 bp的两种不同长度序列类型,A序列类型263 bp,在研究群体中有15个等位基因;B序列类型260 bp,在研究群体中有8个等位基因。在分析的74个氨基酸变异位点上检测到12个正向选择位点。在9个个体中检测到分布频率最高的等位基因,也有多个等位基因只存在一个个体中。单个个体中最多存在6个等位基因。遗传多态性分析表明中华菊头蝠DRB基因具有较高的多态性。中华菊头蝠DRB基因可能至少存在3个重复座位。利用已发表的翼手目DRB第二外显子序列构建的系统进化树表明中华菊头蝠MHCⅡ-DRB基因处于独立进化支。

大足鼠耳蝠MHCⅡ-DRB基因第二外显子的克隆及序列分析

为了研究大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB基因第二外显子的多态性以及大足鼠耳蝠与其他物种的亲缘关系,试验采用PCR产物直接测序方法获得江西和云南两地的大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB基因第二外显子序列,然后利用BioEdit、Clustal X和Mega软件对测得的序列进行分析,并将其与GenBank中的囊翼蝠、反刍类、灵长类、啮齿类等物种的MHCⅡ-DRB基因第二外显子构建系统发生树。结果表明:大足鼠耳蝠的MHCⅡ-DRB第二外显子序列大小为224 bp,编码74个氨基酸,均具有高度的多态性;江西和云南两地的大足鼠耳蝠聚集为一支,而与包括囊翼蝠在内的其他物种分离开。

黄麂Mhc-DRB基因多态性及其维持机制

利用牛DRB3特异性引物(LA31和LA32),通过聚合酶链式反应(PCR)、单链构象多态性(SSCP)以及克隆测序技术,从12只黄麂个体中共获得20个DRB第二外显子等位基因,其中6个个体具有3～4个等位基因,提示利用该引物从黄麂中至少可以扩增出2个DRB位点。所有序列均无插入、缺失和终止密码子。基于序列比对(与牛DRB3和鹿科DRB基因同源性非常高),以及所检测到的氨基酸变异位点主要位于抗原结合区,推测本文所获得的黄麂序列为表达的、且具有重要功能的DRB位点。抗原结合区氨基酸位点的非同义替换(dN)显著大于同义替换(dS)(P<0.01),说明历史上黄麂DRB基因经历过正选择作用。CODMEL程序中的模型M7和M8似然比检测(Likelihood ratio test,LRT)结果同样支持上述推论。进一步利用经验贝叶斯法准确地检测出6个受正选择作用的氨基酸位点(位点11、37、61、67、71、86),其中的5个位点位于PBR区。因此,正选择作用可能是维持黄麂DRB基因多态性的主要机制之一。基于DRB外显子2序列利用邻接法(NJ)构建了部分偶蹄动物系统发生关系,在NJ树上,黄麂DRB基因与其它鹿科动物DRB基因呈镶嵌式分布,提示跨物种进化是维持黄麂DRB基因多态性的另一重要机制。此外,黄麂两个等位基因(Mure-DRB1和Mure-DRB11)和马鹿的两个等位基因(Ceel-DRB34和Ceel-DRB46)与牛科的等位基因构成一个独立的进化枝,说明黄麂和马鹿的某些DRB基因具有非常古老的谱系。

吉林地区马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子的克隆及序列分析

为了研究翼手目序列中马铁菊头蝠DRB基因第2外显子的遗传多态现象,试验检测了从一个种群得到的17个蝙蝠个体。结果从17个个体中克隆获得42条不同序列,长度为263 bp(仅4例为260 bp)。经序列分析发现,部分个体存有多种序列、不同个体间存有相同序列,提示马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子可能存在着重复座位和基因共享。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA软件构建的NJ树表明,马铁菊头蝠聚为一支,而与其他动物分离。结果表明:马铁菊头蝠MHCⅡ-DRB基因第2外显子有较高的多态性,这与其他哺乳动物很相似。

三种猫科动物MHC Class Ⅱ DRB等位基因序列变异性分析

分析了云豹(Neofelisnebulosa)、豹(Pantherapardus)和东北虎(Pantheratigrisaltaica)等3种猫科动物的主要组织相容性复合物ClassⅡDRB座位的等位基因序列变异性。使用一对简并性引物扩增了DRB座位第二外元目标片段。用单链构像多态性分析方法确定不同的单倍型。每个个体挑出15个单克隆用来分离、纯化和测序。实验中从4个个体中获得了8种不同序列。237bp核苷酸序列中发现有59个变异位点。根据人类的抗原肽结合区推测79个氨基酸位点中存在21个假定的抗原肽结合位点,而且非同义替换率明显高于同义替换率,这可能说明了第二外元的较高变异性是由平衡选择作用来维持的。重建的NJ树和MP树显示豹和东北虎的亲缘关系较近,而两者与云豹的亲缘关系较远。

长江江豚MHCD-RB基因第二外显子的分离鉴定

主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)在脊椎动物的免疫系统中起着重要的作用,常作为适应性遗传标记应用于保护遗传学研究。长江江豚(Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis)是惟一生活于淡水环境中的江豚种群,且已处于濒危状况。为了开发适用于长江江豚保护遗传学研究的MHC遗传标记,首次采用北象海豹(Mirounga angustirostris)的一对DRB基因引物对长江江豚的基因组进行扩增,从5个个体中成功扩增并测序得到5条MHCDRB基因第二外显子188 bp的核苷酸序列。BLAST结果表明这5条DRB特异序列与Gen-Bank中白鲸(Delphinapterus leucas)的DRB2序列具有较高的同源性,从而证实得到了预期扩增位点。进一步分析发现:这5条序列在4个核苷酸位点上产生替代,翻译后氨基酸序列在3个位点上发生替代;均具有完整的开放阅读框;且核苷酸的非同义替代率远远高于同义替代率;此外,从同一个体分离到两种以上不同DRB核苷酸序列,暗示着长江江豚在DRB座位上可能存在基因重复现象。初步分析结果表明长江江豚的DRB基因具有核苷酸多态性和氨基酸多态性及潜在功能性,并经受着强烈的自然选择。因此,该DRB座位可以作为适应性遗传标记进一步用于长江江豚遗传多样性以及种群适应能力评估等保护遗传学研究。

中国荷斯坦牛BOLA-DRB上游近端调控区序列分析

通过PCR扩增及DNA序列测定,得到了中国荷斯坦牛BOLA-DRB基因的5'上游近端调控区(URR)序列。比较发现,与人、马以及羊的MHC-DRB基因的5'URR类似,牛MHC-DRB基因5'URR区同样存在与基因表达调控有关的高度保守的W、X、Y、CCAAT及类TATA调控元件,调控元件的组织结构也相同。