五龙鹅MHC ClassⅠ基因克隆及同源建模研究

主要组织相容性复合体（MHC）与动物机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。从GenBank/DDBJ/EMBL基因库中读取鸡、其他鸟类、爬行类和哺乳类的MHC ClassⅠ基因进行序列分析设计引物，使用LA—PCR法从五龙鹅的基因组中克隆了MHC ClassⅠ基因序列（DNA序列和mRNA序列GenBank登录号分别为：AM114925和AM114924），并分析其基因组结构。运用生物信息学技术对测序结果进行分析显示：基因组DNA由8个外显子和7个内含子组成，与鸡基因序列同源率为60．8％～64．1％，与人的同源率为42．9％。分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸡、其他鸟类、爬行类、哺乳类以及人类的进化关系，同源建模分析发现该基因由氨基末端结构域和羧基末端结构域构成。

草鱼MHC class Ⅰ基因多态性及其与鱼体抗柱形病能力关系分析

用1对引物HMC6-S和MHC6-A分别从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)40尾抗病个体和40尾易染个体的基因组DNA中扩增MHC基因片段,扩增产物长度为262bp。在262bp的核苷酸序列中,有50个(19%)多态位点。在其编码的87个氨基酸位点中,有16个多态位点(18.39%),其中有10个位点发生在多肽结合位点上(62.5%)。对核苷酸替代的类型和位点进行分析,发现多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率均大于非多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率,表明氨基酸替代替换集中出现在多肽结合位点(PBR)上。分析80个个体的测序结果,发现有17种不同的MHC classⅠ等位基因,编码17种不同的氨基酸序列。等位基因A、B、C、D是2个群体共有的,其中等位基因A出现的频率最高,占总样本数量的36.25%;等位基因E、F、G、H、I、P只出现在抗病个体中,等位基因J、K、L、M、N、O、Q只出现在易染个体中。

建鲤MHC classⅠ基因全长cDNA的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法克隆了建鲤(Cyprinus carpio var.jian)MHC classⅠ基因全长cD-NA并进行了序列分析。结果显示:实验得到了1914 bp的建鲤的MHC classⅠ全长cDNA序列;建鲤MHC classⅠ基因包括1044 bp的开放阅读框(ORF),118 bp的5'非编码区(UTR)以及752 bp的3'非编码区(UTR),含有保守的半胱氨酸残基,N-糖基化位点。氨基酸序列比对结果显示,建鲤MHC classⅠ与日本鲤的MHC classⅠ相似性最高,为66.0%;与虹鳟、大西洋鲑、青鳉、红鳍东方鲀的相似性分别为54.5%、57.9%、44.3%、42.0%,与小鼠、大鼠、人的相似性分别为29.1%、28.7%、29.7%。

虎MHC ClassⅠ基因的克隆及测序

根据猫的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子cDNA序列设计PCR引物,从基因组上成功扩增并克隆了MHCClassⅠ基因片段,命名为TLA-A。该片段全长2 820 bp,包含MHC ClassⅠ分子基因约85%的长度,包括Exon 1部分序列、intron 1、exon 2、intron 2、exon 3、intron 3、exon 4、intron 4、exon 5、intron 5、exon 6、intron 6和exon 7部分序列。与其他物种的ClassⅠ基因相比,虎与家猫、猎豹、豹猫、大熊猫、狗、马、松鼠猴、人、黄猩猩等物种的同源性依次为93.4%、91.8%、87.3%、86.4%、85.1%、85.1%、84.6%、84.3%、83.7%,种间序列差异主要表现在exon 2、exon 3两个肽结合区。

中国美利奴羊MHC class Ⅰ区段基因组成预测分析

为了准确筛选中国美利奴羊MHC classⅠ区段,试验采用GenScan软件对覆盖绵羊MHC classⅠ区段的11个BAC克隆测序结果进行预测,在GenBank数据库中BlastX比对分析预测的基因,获得的信息在KEGG数据库中进行基因注释。结果表明:覆盖绵羊MHC classⅠ区段的11个BAC克隆共预测出基因数123个,其中编码抗体基因19个,占预测基因总数的15%;其他基因65个,占53%;未知基因39个,占32%;并明确了预测基因在BAC克隆上的分布情况及其编码的多肽可能具有的生物学功能。

朝鲜鹌鹑MHC class Ⅰ基因第2、3外显子多态性与NDV抗性的关联分析

【目的】研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2和3外显子的多态性,并与新城疫病毒抗性进行关联分析。【方法】采用胸肌注射的方法对14日龄朝鲜鹌鹑进行新城疫La Sota弱毒株攻毒,每周注射1次,连续攻毒3周后,心脏采血,采用β-微量法测定血清中新城疫抗体水平。PCR扩增朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因,测序后采用DNA Star、SPSS等分析软件研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2,3外显子的多态性,并分析不同基因型新城疫抗体水平的差异。【结果】朝鲜鹌鹑的新城疫抗体效价为26～210。PCR扩增获得了1 290bp的MHC classⅠ基因,其编码区序列为780bp,编码259个氨基酸。通过与已知序列日本鹌鹑RNA(AB005528)比对,得到长度分别为76,272和274bp的第1,2和3外显子。在第1外显子上未检测到突变为点,在第2和3外显子上共检测到11个突变位点(第2外显子上4个突变位点:257bp(A/C)、267bp(A/T)、366bp(A/G)和500bp(T/G);第3外显子上7个突变位点:795bp(T/C)、798bp(T/C)、810bp(T/G)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、927bp(A/G)和932bp(C/G)),均为中度多态基因座,11个突变位点中,267bp(A/T)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变导致编码氨基酸改变,500bp(T/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变位点基因型之间新城疫抗体水平存在显著差异(P<0.05)。【结论】朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第2、3外显子具有丰富的多态性,并且与新城疫病毒抗性相关。

Prokaryotic Expression and Monoclonal Antibody Preparation of Chicken Major Histocompatibility Complex Class II Molecules

[ Objective] To prepare the monoclonal antibody against chicken major histocompatibility complex class II molecules （MHC II）. [ Method ] The prokaryotic expression of the gene fragments of exons 2 -6 encoding alpha chain of MHC II and exons 3 -6 encoding beta chain of MHC II were performed based on its protein sequences. After BALB/c mice were immunized with the purified fusion proteins, the mouse spleen cells were fused with mouse myeloma cells SP2/0. Then the positive hybridoma cells were screened and detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. [ Result] One hybridoma cell strain secreting monoclonal antibody against alpha chain and two strains secreting monoclonal antibody against beta chain were obtained. These three hybridoma cell strains were named as MHC II alpha-4, MHC II betas-2 and MCH II betas-31, respectively. Their titers of ascites in indirect ELISA were 1 ： 256 000, 1 ： 256 000 and 1 ： 1 280 000, respectively. These antibodies could specifically recog- nize MHC II alpha chain or beta chain in western blotting. [ Conclusion] Three obtained hybridoma stains can stably produce the monoclonal antibody against chicken MHC class II molecules.

穿膜序列对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递影响的研究

目的 :从时间依赖性抗原呈递动力学的角度研究穿膜序列 (CPP)对 MHC- 类限制性 CTL 表位呈递的影响。 方法 :应用多肽固相合成技术 ,分别合成含 CPP与 H- 2 Kb限制性 CTL 表位 OVA2 57- 2 6 4的融合多肽 ,同时合成该表位 N、C端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪 (FACS)分析技术 ,检测抗原呈递细胞 (APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行 MHC- 类呈递的情况。结果 :与不含 CPP的抗原肽相比 ,含 CPP的抗原肽中的 CTL 表位更易进入 APC内 MHC- 类呈递途径 ,表现为呈递所需时间明显缩短 (P<0 .0 5 ) ,且同一时相点的呈递强度显著增加 (P<0 .0 5 )。 结论 :在外源性抗原肽中引入穿膜序列可明显促进其 MHC- 类限制性 CTL 表位的呈递效率 。

CPP Tat_(49-57)促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的研究穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术,将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264,同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-OVA257-264。采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学,并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点,APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended-OVA257-264;氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递,而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应;Tat49-57-OVA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递,其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2extended-OVA257-264的呈递。此外,RMAS固定后则丧失对Tat49-57-OVA257-264和NH2 extended-OVA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力,但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽OVA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈,表现为动力学显著增强,且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

淮南麻黄鸡MHCⅠα链基因的克隆及序列分析

典型的主要组织相容性复合体（MHC）是抗原递呈的关键分子,具有重要的免疫功能,与多种疾病密切相关。为深入了解地方品种鸡MHCⅠ类α分子的特征,尤其是抗原结合区域的特点,通过RT-PCR技术获得了29个淮南麻黄鸡完整的α链基因,并进行了分析。结果显示,淮南麻黄鸡MHCⅠα分子高度多态,但主要集中在α1和α2区域,该区变异氨基酸位点共68个,其中高度变异22个。淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域氨基酸序列同源性介于79.3%-99.5%之间,仅少部分序列完全一致。鸡氨基酸序列同源性与鸭较高,介于57.6%-64.1%之间;其次为人和鼠。进化分析显示,淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域分属于两个类群,但未显示明显的品种差异。此外,鸡与鸭的亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。研究结果表明,淮南麻黄鸡MHC分子在进化过程中呈现高度的多态性,但受到病原体的选择压力,多态性主要位于抗原肽结合部分的α1和α2区域。

ER滞留信号肽对外源CTL表位进入胞内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的促进作用

目的探讨哺乳动物内质网(endoplasmic reticulum,ER)滞留信号肽(retrieval signal sequence)能否促进外源CTL表位肽进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径。方法应用多肽固相合成技术将哺乳动物内质网滞留信号——赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL)基序融合在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的羧基端,同时合成该表位和氨基端自然延伸四个氨基酸(TEWT)的对照肽OVA257-268。选择巨噬细胞系Ana-1作为本研究的APC,采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测各抗原肽在Ana-1内的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学。结果羧基端KDEL基序可明显增强与之偶联的CTL表位在APC内的MHC-Ⅰ类抗原呈递效率,并且显著延长APC表面MHC/肽复合物的呈递时间。结论羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的一个简单有效的新策略,可为肿瘤治疗性肽疫苗的分子设计与研究提供新思路和实验依据。

携带非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A穿膜区等位基因中晚期食管癌患者对NK细胞免疫治疗的敏感性高

目的:探讨非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)穿膜区等位基因对中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗疗效的影响。方法:选取福建省肿瘤医院2013年4月至2015年10月收治的中晚期(TNMⅢ-Ⅳa期)食管癌患者152例,均在姑息性手术后行全身化疗,根据患者MICA穿膜区等位基因是否为A5.1分为4组:(1)A5.1化疗+NK细胞治疗(A5.1+NK)组;(2)A5.1单纯化疗(A5.1)组;(3)非A5.1化疗+NK细胞治疗(no A5.1+NK)组;(4)非A5.1单纯化疗(no A5.1)组,观察各组患者临床疗效。构建食管癌组织标本MICA等位基因A5.1的真核表达载体p TE-1A5.1,转染食管癌TE-1细胞株;Western blotting检测p TE-1A5.1转染对TE-1细胞MICA蛋白表达的影响,LDH法检测TE-1细胞转染p TE-1A5.1前后对NK细胞杀伤敏感性的变化,ELISA法检测食管癌患者血清可溶性MICA及转染p TE-1A5.1前后TE-1细胞上清中可溶性MICA含量。结果:经过3年的随防,A5.1+NK组患者中位总生存期(medium overall survival,m OS)为15.0个月,A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组为22.4个月,no A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.05)。经Cox多因素回归分析发现,患者年龄、性别、ECOG评分及基因型与预后均无明显相关(P>0.05),将基因类型与是否NK细胞治疗进行交叉分析,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.01)。转染p TE-1A5.1后TE-1细胞内MICA表达显著升高,培养液上清可溶性MICA分泌明显增加[(256.2±45.3)vs(45.3±11.5)pg/ml,P<0.01];与转染前相比,NK细胞对过表达MICA的TE-1细胞的杀伤率明显降低[(29.5±7.2)%vs(42.5±7.1)%,P<0.05]。结论:相对中晚期食管癌MICA穿膜区A5.1等位基因患者,非A5.1基因患者手术后化疗联合NK细胞的疗效较好,其机制与其不容易产生可溶性MICA密切相关。

卵巢癌细胞MHC-Ⅰ类抗原表达与肿瘤微环境免疫细胞分布关系

目的 探讨卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达与肿瘤微环境免疫活性细胞分布的关系 ,了解机体肿瘤微环境免疫功能状态。方法 用流式细胞仪检测卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达 ,同时用免疫组化方法检测肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布情况。结果 卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达存在不同程度的下降或缺如 ,且与肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布呈正相关 ,前者r=0 .846 ,P =0 .0 0 0 1,后者r =0 .738,P =0 .0 0 0 1。结论 上皮性卵巢癌细胞MHC Ⅰ类抗原分子的表达影响肿瘤微环境中浸润免疫细胞数 ,进而影响肿瘤微环境免疫监视能力。检测MHC Ⅰ类分子表达可为肿瘤浸润淋巴细胞临床过继治疗选择合适病例提供实验依据。

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。

MHCⅠ类分子及ICAM-1在IL-2、IL-4、IL-6基因转染的瘤苗在诱导CTL中的作用

本文研究了IL-2、IL-4、IL-6基因转染后B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1的表达水平,并探讨了其在CTL诱导过程中的作用.结果表明,IL-2、IL-4、IL-6基因转染的B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1表达均高于野生型B16黑色素瘤细胞及转染对照质粒的B16黑色素瘤细胞.体内接种后,小鼠脾脏CTL活性明显增强,CTL培养体系中IFN-γ、TNF-α的分泌水平也增高.在CTL诱导体系中加入抗ICAM-1单抗可以抑制CTL的活化,加入抗MHCⅠ类分子单抗后可使CTL的活化完全阻断.这提示细胞因子基因转染可能通过使肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达增加,从而增强瘤苗的免疫原性.

MHCⅠ类分子胞内转运机制研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子在细胞内的转运过程大致可分为以下3个环节:1)新合成的MHCⅠ类分子在内质网(endoplasmic reticulum,ER)腔内装载抗原肽;2)肽-MHC分子复合体经过囊泡转运由高尔基体(Golgi apparatus)到达细胞膜表面,活化CD8+T细胞;3)细胞对MHCⅠ类分子的回收过程。近年来的研究显示,此转运过程中涉及泛素化、内吞作用等机制,而多种病毒可干扰MHCⅠ类分子的各转运环节,达到免疫逃避的目的。故本文针对近年该领域的研究进展作一综述。

草药S抑制大鼠移植肾排斥反应中MHC Class Ⅱ分子表达的研究

为探索草药Ｓ抗大鼠同种异体肾移植急性排斥的作用机理，采用改进的Ｆａｂｒｅ和Ｋａ－ｍａｄａ大鼠原位肾移植模型，将ＳＤ大鼠肾移植给Ｗｉｓｔａｒ大鼠为同种异体移植，Ｗｉｓｔａｒ移植给Ｗｉｓｔａｒ大鼠为同品系移植（空白对照），共设五个实验组，观察移植后受体鼠存活、检测移植肾功能及定量测定移植肾内ＭＨＣＣｌａｓⅡ抗原分子的表达。结果表明，草药Ｓ能延长受体鼠存活时间，并抑制ＭＨＣＣｌａｓⅡ在移植肾内的表达（与不用药物组比较Ｐ＜０．０１），Ｓ药加小剂量环孢素Ａ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅＡ，ＣｓＡ）治疗组与同系组相比差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。这些结果提示，移植肾内ＭＨＣＣｌａｓｓⅡ表达水平的高低与其排斥的强弱有相关性。

细胞因子对小鼠肺癌细胞MHC Ⅰ类分子和共刺激分子的调节作用

目的观察T细胞活化因子对小鼠肺癌细胞表达MHCⅠ类分子和共刺激分子的调节作用,探讨细胞因子增强特异性抗肿瘤应答的免疫效果。方法用rhIL-2和IFN-γ分别活化对数生长期的小鼠lewis肺癌3LL细胞48h,FACS检测细胞因子活化前后3LL细胞表达MHCⅠ类分子(H-2)和共刺激分子(CD80)的荧光强度。结果3LL细胞低表达H-2和CD80,经rhIL-2和IFN-γ活化48h后,3LL表达H-2和CD80的荧光强度明显增强,rhIL-2的活化的两种分子荧光强度高于IFN-γ。结论rhIL-2和IFN-γ能上调小鼠lewis肺癌3LL细胞表面MHCⅠ类分子和共刺激分子的表达,增强体内特异性抗肿瘤免疫应答。

MHC-Ⅰ类分子抗原呈递相关蛋白与乙肝相关性研究

目的探讨正常肝组织与乙型肝炎中TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白表达及相关关系。方法以内源性生物素阻断S-P法来检测32例乙肝患者和16例健康对照者石蜡包埋肝组织的TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白表达情况。结果β2-MG、TAP1、HSP70、HSP90、CNX蛋白在乙肝组表达高于正常组(P均<0.05);通过相关性分析发现,TAP2蛋白与HSP70蛋白在正常组中呈相关性(χ2=16.000,P=0.008)。结论TAP1、TAP2、HSP70、HSP90、CNX、β2-MG蛋白均在乙肝组表达高于正常组(P<0.05),提示这些蛋白均参与MHC-Ⅰ类分子的乙肝病毒抗原处理及提呈过程,并且可以做为诊断乙肝的临床指标。