草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长cDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5′端非编码区以及256bp的3′端非编码区.氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79%,与斑马鱼的相似性为75%,与人的相似性最低,为34%.RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱.

大菱鲆(Scophthalmus maximus)MHCⅡA基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到1131bp的大菱鲆MHCⅡA全长cDNA片段。该序列包括720bp的开放阅读框(0RF),75bp的5′末端非编码区(UTR)以及336bp的3′末端非编码区。利用CLASTAL W1.8软件进行MHCⅡA基因的氨基酸序列比对和同源性比较,结果表明,大菱鲆MHCⅡA与牙鲆MHCⅡA的相似性最高,为69.8%,与真鲷、鲈鱼和丽鱼的相似性次之,分别为65.5%、69.6%和61.4%,与人、鼠和鲨鱼MHCⅡA的相似性仅为19.8%、31.6%和26.9%。应用RT-PCR分析其组织表达发现MHCⅡA基因在正常大菱鲆组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中在鳃、脾、头肾、心脏、小肠和皮肤中有较强的转录本,中等程度表达于肝和血,在性腺和肌肉中表达最弱。

军曹鱼MHC-Ⅱα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

本研究根据其他鱼类MHC-Ⅱα基因的保守序列设计兼并引物,运用同源克隆和末端快速扩增方法扩增了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列,并对cDNA及其氨基酸序列进行了分析,比较了军曹鱼和其他物种的MHC-Ⅱα氨基酸序列的差异,分析了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的组织分布及经LPS刺激后头肾组织中MHC-Ⅱα基因的表达变化。结果表明,军曹鱼MHC-ⅡαcDNA全长998 bp,包括53 bp的5′末端非编码区（5′UTR）、234 bp的3′末端非编码区（3′UTR）及711 bp的开放阅读框（ORF）,编码236个氮基酸,其蛋白质分子质量约为25.94 ku,等电点为4.39;军曹鱼MHC-Ⅱα蛋白质序列具有一些重要的特征,包括前导肽、α1、α2、CP/TM/CYT区和保守的半胱氨酸等;军曹鱼MHC-Ⅱα与鼠、人及其它鱼类的氨基酸同源性在25.0%~69.5%之间。Real-ti me PCR检测结果显示,MHC-Ⅱα基因在正常军曹鱼组织中均有表达,但其表达量在各种组织中存在差异,其中较强表达于头肾、鳃,中等程度表达于脾脏、肠,在心脏、脑、肌肉中表达较弱;经LPS刺激后,头肾中MHC-Ⅱα基因表达下调。

圆斑星鲽MHC ⅡB基因结构、多态性及组织表达分析

通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1144bp,5'UTR(untranslated region)为7bp,3'UTR为450bp,开放阅读框(ORF)长度为687bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1)、IGC区(β2)、跨膜区和胞质区5个结构域。同源分析表明,圆斑星鲽MHCIIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%～79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鲨的相似性较低,分别为34%、33%、31%和30%。圆斑星鲽MHC ⅡB基因含有5个内含子,与其他硬骨鱼不同,其β2结构域编码区内存在1个109bp的内含子。根据获得的MHC ⅡB基因组序列设计特异性引物,在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388bp的DNA片段,PCR产物直接测序后发现在270bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异,密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位。利用荧光定量PCR分析组织表达发现,MHCIIB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有表达,但表达量存在差异,肾的表达量最高,肌肉的表达量最低,肾、心、脾脏和鳃的表达量显著高于肝、皮肤、脑、血和肌肉。本研究旨在为MHC基因家族的遗传进化分析、结构与功能的解析提供基础,同时为圆斑星鲽的分子免疫学和标记辅助育种研究提供参考依据。

小鼠心肌MHC和TM1基因表达的运动训练实验研究

从对心肌MHC和TM1基因表达的影响,探讨韭楂泥鳅汤提高小鼠运动能力的作用及机制。将健康雄性ICR小鼠32只,按体重分层随机分为安静对照组(C)、运动训练组(T)、泥鳅运动组1(N1)、泥鳅运动组2(N2),每组8只。T组和N组游泳训练三周后,尾根部负重5%进行力竭游泳,记录游泳至力竭时间。24 h后取材,检测心系数,HE染色观察心肌组织结构,RT-PCR测定心肌组织α-MHC、β-MHC和TM1的基因表达。表明:与T组比较,小鼠的力竭运动时间N1组显著延长(P<0.05),N2组呈延长趋势但无显著性差异(P>0.05)。与C组比较,T组小鼠的心系数显著增高(P<0.05),N1组呈增高趋势而无显著性差异(P>0.05);光镜下,C组心肌细胞界限清晰、结构正常;力竭后24 h,T组的心肌细胞界限模糊,可见心肌纤维断裂和间质水肿,而N1组接近C组;与C组比较,T组的β-MHC mRNA表达显著增高(P<0.05),α/β-MHC mRNA比值显著降低(P<0.05);N1组的α-MHC mRNA、β-MHC mRNA和TM1 mRNA表达较C组和T组均增高(P<0.05),但α/β-MHC mRNA比值与C组差异不显著(P>0.05)。合适应用韭楂泥鳅汤能延长小鼠力竭游泳时间,具有抗运动疲劳作用,与其稳定肌球蛋白重链基因表达比和增强原肌球蛋白1基因的表达相关。

醋制泥鳅对游泳训练并力竭小鼠心肌HGF和MHC基因表达的影响

本文探讨了醋制泥鳅对小鼠运动耐力的影响机制.将24只健康雄性ICR小鼠分为安静对照组(A组)、运动训练组(T组)、泥鳅运动组(V组).T组与V组小鼠游泳训练三周后进行力竭游泳,24 h后取材计算心系数,HE染色光镜下观察心肌组织,RT-PCR法检测心肌肝细胞生长因子(HGF)和肌球蛋白重链(MHC)基因的表达.结果表明:V组小鼠的力竭游泳时间非常显著地长于T组(P<0.01);T组的心系数显著高于A组和V组(P<0.05),并可见心肌细胞界限模糊、心肌纤维断裂和间质水肿,而A组与V组无明显病理表现;与A组比较,T组的HGF、β-MHC mRNA表达显著增高(P<0.05)和α/β-MHC mRNA比值显著降低(P<0.05),V组的HGF、MHC mRNA和α/β-MHC mRNA值差异不显著(P>0.05);V组的α/β-MHC mRNA值显著高于T组(P<0.05).总之,醋制泥鳅能明显提高负荷游泳训练小鼠的运动耐力,与减轻心肌损害和促进心肌MHC mRNA表达比值的稳定关系密切.

高住低训对骨骼肌蛋白质合成的作用及机理

研究目的:模拟高住低训,测试并分析大鼠血睾酮、骨骼肌睾酮、骨骼肌ARmR-NA表达、骨骼肌总蛋白含量、骨骼肌MHC含量的变化,探讨高住低训,尤其是高住低氧对骨骼肌蛋白质合成的作用及其机理。研究方法:健康雄性SD大鼠40只,随机分为4组:常氧安静组、低氧暴露组、常氧运动组、高住低训组。常氧安静组在常氧环境下安静生活,低氧暴露组晚上在常压低氧帐篷中低氧暴露12 h,常氧运动组白天在常氧环境中进行耐力运动1 h,高住低训组在白天进行1 h耐力运动后,晚上在低氧帐篷中进行低氧暴露,运动和低氧暴露的方式和时间分别同常氧运动组和低氧暴露组。在实验第28 d取材测试指标。研究结果:1)常氧运动组比常氧安静组骨骼肌总蛋白质含量升高,有显著性差异(P<0.05),MHC含量明显升高,有非常显著性差异(P<0.01)。2)低氧暴露组比常氧安静组血睾酮和骨骼肌睾酮含量下降,均有显著性差异(P<0.05)。3)高住低训组比常氧运动组血睾酮、骨骼肌睾酮含量明显降低,骨骼肌总蛋白含量和MHC含量下降,均有显著性差异(P<0.05),腓肠肌湿重和体重明显下降,有显著性差异(P<0.05)。4)各组骨骼肌睾酮含量的变化趋势与血睾酮的变化基本一致。结论:1)本研究选用的耐力运动模型有效地促进了骨骼肌蛋白质的合成代谢,在此基础上进行低氧暴露模拟高住低训研究骨骼肌蛋白质合成的调控是可行的。2)运动后进行低氧暴露降低睾酮水平,抑制蛋白质合成,可能是骨骼肌重量和体重下降的一个主要原因。3)血睾酮浓度在一定程度可反映骨骼肌睾酮含量的变化。

双肾双夹肾性高血压大鼠左心室肌球蛋白重链同型异构基因转录的变化

目的和方法 :测定双肾双夹 ( 2K2C)肾性高血压大鼠早期 ,左心室α -肌球蛋白重链 (α -MHC)和 β 肌球蛋白重链 ( β MHC)mRNA水平的变化。实验分四组 :对照组、2K2C组、巯甲丙脯酸组、巯甲丙脯酸对照组。术后 2 4h、36h、48h、72h测动脉血压 ,提取左心室总RNA ,各样本取 8.0 μg ,与 32 P标记的α MHC和 β -MHCcDNA探针作斑点杂交。结果 :高血压大鼠左心室α MHCmRA水平明显降低 ,β MHCLmRA水平明显升高 ,且该变化可明显被巯甲丙脯酸所抑制。结论 :肾性高血压早期 ,MHC基因表达发生改变 ,肾素—血管紧张素系统 (RAS)

氯沙坦对大鼠废用性骨骼肌不同肌球蛋白亚型基因表达的影响

目的探讨氯沙坦对大鼠废用性骨骼肌不同肌球蛋白亚型基因表达的影响。方法采用大鼠尾部悬吊2周建立废用性肌肉萎缩模型,药物干预组给予氯沙坦灌胃2周。采用实时荧光定量PCR测试比目鱼肌中不同肌球蛋白亚型基因表达量,冰冻切片测试骨骼肌中毛细血管密度和毛细血管数/肌纤维数比值。结果 (1)与C组相比,TS组大鼠体重、比目鱼肌重量和相对重量均降低(P<0.05或P<0.01),与TS组相比,TD组大鼠体重、比目鱼肌重量和相对重量均升高(P<0.05);(2)与C组相比,TS组、TD组大鼠比目鱼肌毛细血管密度和毛细血管数/肌纤维数比值显著下降(P<0.05),TD组与TS组相比有显著性增加(P<0.05);(3)与C组相比,TS、TD组的MHC I mRNA、MHCⅡa mRNA、MHCⅡb mRNA表达量均降低(P<0.01、P<0.05、P<0.05),TD组的MHC I mRNA表达量与TS组相比升高(P<0.05)。结论大鼠尾部悬吊14天,比目鱼肌出现明显萎缩。服用氯沙坦可通过改善比目鱼肌的血液循环,提高MHC I mRNA的表达,具有一定的抑制骨骼肌萎缩作用。

军曹鱼MHC-Ⅱβ基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,得到1161bp的军曹鱼(Rachycentron canadum)MHC-Ⅱβ全长cDNA片段。该序列包括20bp的5′末端非编码区(UTR),394bp的3′UTR及747bp的开放阅读框(ORF),编码248个氨基酸,预测其蛋白质分子量约为27.99ku,等电点为6.21。通过构建MHC-Ⅱβ氨基酸序列的系统进化树,并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类、鼠(Musmusculus)、鸡(Gallus gallus)及人类(Homo sapiens)MHC-Ⅱβ氨基酸的同源性在28.5%～77.5%之间。所推测的蛋白序列具有一些重要的特征,包括:前导肽、β1、β2和CP/TM/CYT区,保守的半胱氨酸等。Real-time PCR检测结果显示,MHC-Ⅱβ基因在正常军曹鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中,头肾表达较强,鳃、脾、肠表达程度中等,在心、脑、肌肉中表达较弱。

低功率激光照射促进大鼠急性骨骼肌钝挫伤肌肉再生

目的探讨635 nm GaAlAs激光照射对急性骨骼肌钝挫伤大鼠组织学愈合进程及腓肠肌Ⅱb型肌球蛋白重链(MHC-Ⅱb)mRNA表达的影响。方法建立大鼠急性骨骼肌钝挫伤模型,激光治疗组采用美国Erchonia EML(ML2)型低功率GaALAs激光器在钝挫伤局部进行照射,正常对照组、自然愈合组不进行照射。通过HE染色光镜观察、透射电镜观察和实时荧光定量PCR法,对损伤区域腓肠肌进行形态学和分子生物学研究。结果HE染色光镜观察和电镜观察结果显示,激光照射组肌肉再生速度显著快于自然愈合组,且胶原纤维生成很少;激光治疗组腓肠肌MHC-Ⅱb mRNA的表达量在损伤后第2、3、7天显著高于自然愈合组。结论635 nm GaAlAs激光能促进急性骨骼肌钝挫伤模型大鼠腓肠肌MHC-Ⅱb mRNA的表达,从而促进肌肉再生,提高愈合质量。