畜禽疱疹病毒逃避CTL识别的策略:干扰MHC-Ⅰ分子抗原递呈途径

畜禽疱疹病毒持续感染会损害养殖动物的健康,影响生产性能。借助自身强大的免疫逃避能力,疱疹病毒可以有效抵抗畜禽宿主免疫系统的识别和清除。疱疹病毒在复制过程中,充分利用宿主细胞加工机制产生多种分子类型,干扰MHC-Ⅰ介导的抗原递呈途径,从而避免被细胞毒性T细胞清除。解析病毒蛋白下调MHC-Ⅰ的分子机制是疱疹病毒研究的热点领域之一。本文总结近十年来畜禽疱疹病毒调节MHC-Ⅰ分子的研究进展,按MHC-Ⅰ递呈抗原的不同阶段详细介绍相关蛋白的分子机制,分析了病毒同源蛋白的结构域和功能差异,指出本研究领域目前存在的问题和今后需要突破的方向,以期为治疗畜禽疱疹病毒感染、开发和优化疫苗提供新的视角。

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论 pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。

猪MHC-Ⅰ α生物素化序列融合基因的构建、表达与纯化

采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果显示,成功构建了融合表达载体pET-P1-BSP和pET-P14-BSP,表达产物以包涵体的形式存在,获得高纯度的P1-BSP和P14-BSP蛋白,为进一步利用亲和素在体外构建SLA-I类分子肽四聚体奠定了基础。

CPP Tat_(49-57)促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的研究穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术,将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264,同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-OVA257-264。采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学,并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点,APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended-OVA257-264;氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递,而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应;Tat49-57-OVA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递,其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2extended-OVA257-264的呈递。此外,RMAS固定后则丧失对Tat49-57-OVA257-264和NH2 extended-OVA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力,但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽OVA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈,表现为动力学显著增强,且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

卵巢癌细胞MHC-Ⅰ类抗原表达与肿瘤微环境免疫细胞分布关系

目的 探讨卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达与肿瘤微环境免疫活性细胞分布的关系 ,了解机体肿瘤微环境免疫功能状态。方法 用流式细胞仪检测卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达 ,同时用免疫组化方法检测肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布情况。结果 卵巢癌细胞MHC Ⅰ类分子表达存在不同程度的下降或缺如 ,且与肿瘤微环境中LCA+ 、CD3 + 细胞分布呈正相关 ,前者r=0 .846 ,P =0 .0 0 0 1,后者r =0 .738,P =0 .0 0 0 1。结论 上皮性卵巢癌细胞MHC Ⅰ类抗原分子的表达影响肿瘤微环境中浸润免疫细胞数 ,进而影响肿瘤微环境免疫监视能力。检测MHC Ⅰ类分子表达可为肿瘤浸润淋巴细胞临床过继治疗选择合适病例提供实验依据。

口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A对自然杀伤细胞与细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性影响的实验研究

目的探讨口腔鳞癌细胞过表达MHC-Ⅰ类链相关蛋白A(MICA)对自然杀伤细胞(NK)与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的影响。方法通过绘制细胞生长曲线、检测细胞周期、进行平板集落形成率及裸鼠皮下成瘤等方法对稳定转染并过表达MICA的口腔鳞癌细胞株进行生物学特性鉴定。采用乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术分析口腔鳞癌细胞过表达MICA对NK与CTL细胞杀伤活性及自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)受体表达的影响。结果口腔鳞癌细胞转染MICA基因后主要生物学特性未发生改变,但能显著增强NK与CTL细胞杀伤活性并上调其表面NKG2D的表达,与未转染及转染空白载体的细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MICA可作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标,值得进一步研究。

携带非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A穿膜区等位基因中晚期食管癌患者对NK细胞免疫治疗的敏感性高

目的:探讨非A5.1型MHC-Ⅰ类相关分子A(MHC classⅠ-related molecules A,MICA)穿膜区等位基因对中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗疗效的影响。方法:选取福建省肿瘤医院2013年4月至2015年10月收治的中晚期(TNMⅢ-Ⅳa期)食管癌患者152例,均在姑息性手术后行全身化疗,根据患者MICA穿膜区等位基因是否为A5.1分为4组:(1)A5.1化疗+NK细胞治疗(A5.1+NK)组;(2)A5.1单纯化疗(A5.1)组;(3)非A5.1化疗+NK细胞治疗(no A5.1+NK)组;(4)非A5.1单纯化疗(no A5.1)组,观察各组患者临床疗效。构建食管癌组织标本MICA等位基因A5.1的真核表达载体p TE-1A5.1,转染食管癌TE-1细胞株;Western blotting检测p TE-1A5.1转染对TE-1细胞MICA蛋白表达的影响,LDH法检测TE-1细胞转染p TE-1A5.1前后对NK细胞杀伤敏感性的变化,ELISA法检测食管癌患者血清可溶性MICA及转染p TE-1A5.1前后TE-1细胞上清中可溶性MICA含量。结果:经过3年的随防,A5.1+NK组患者中位总生存期(medium overall survival,m OS)为15.0个月,A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组为22.4个月,no A5.1组为16.0个月,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.05)。经Cox多因素回归分析发现,患者年龄、性别、ECOG评分及基因型与预后均无明显相关(P>0.05),将基因类型与是否NK细胞治疗进行交叉分析,no A5.1+NK组m OS明显长于其他3组(P<0.01)。转染p TE-1A5.1后TE-1细胞内MICA表达显著升高,培养液上清可溶性MICA分泌明显增加[(256.2±45.3)vs(45.3±11.5)pg/ml,P<0.01];与转染前相比,NK细胞对过表达MICA的TE-1细胞的杀伤率明显降低[(29.5±7.2)%vs(42.5±7.1)%,P<0.05]。结论:相对中晚期食管癌MICA穿膜区A5.1等位基因患者,非A5.1基因患者手术后化疗联合NK细胞的疗效较好,其机制与其不容易产生可溶性MICA密切相关。

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的克隆、序列分析及表达载体构建

【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且...

ER滞留信号肽对外源CTL表位进入胞内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的促进作用

目的探讨哺乳动物内质网(endoplasmic reticulum,ER)滞留信号肽(retrieval signal sequence)能否促进外源CTL表位肽进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径。方法应用多肽固相合成技术将哺乳动物内质网滞留信号——赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL)基序融合在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的羧基端,同时合成该表位和氨基端自然延伸四个氨基酸(TEWT)的对照肽OVA257-268。选择巨噬细胞系Ana-1作为本研究的APC,采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测各抗原肽在Ana-1内的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学。结果羧基端KDEL基序可明显增强与之偶联的CTL表位在APC内的MHC-Ⅰ类抗原呈递效率,并且显著延长APC表面MHC/肽复合物的呈递时间。结论羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的一个简单有效的新策略,可为肿瘤治疗性肽疫苗的分子设计与研究提供新思路和实验依据。

不同运动方式对大鼠骨骼肌急性拉伤修复过程中MHC-Ⅱ,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的影响

目的:了解不同运动方式(离心运动、向心运动)对骨骼肌拉伤愈合过程中肌肉再生和纤维化过程的影响。方法:将120只成年雌性SD大鼠随机分为空白组(BC组,n=8)、即刻组(IM组,n=8)、第1周组(1W组,n=8)、自然愈合组(NC组,n=32)、向心运动组(CE组,n=32)、离心运动组(EE组,n=32)。造成腓肠肌急性拉伤模型1周后,对CE组、EE组分别进行为期4周的向心和离心训练。IM组造模即刻、1W组造模后7天、BC组造模后18天取材;其余各组分别在造模后第14天、第21天、第28天、第35天4个时间段,每个时间段随机选择8只大鼠取材,用免疫组化的方法检测大鼠腓肠肌Ⅱ型肌球蛋白重链(MHC-Ⅱ)及Ⅰ、Ⅲ型胶原(COL-Ⅰ和COL-Ⅲ)水平。结果:损伤恢复的各个阶段,CE组MHC-Ⅱ水平较NH组和EE组高,并且恢复速度较快,而COL-Ⅰ和COL-Ⅲ水平较NH组和EE组低;EE组MHC-Ⅱ水平较NH组和CE组低,COL-Ⅰ水平较NH组低但高于CE组;COL-Ⅲ水平高于CE组和NH组。结论:不同运动方式对骨骼肌急性损伤后的修复过程影响不同,向心运动能有效促进损伤骨骼肌MHC-Ⅱ合成,从而加快骨骼肌再生,离心运动对MHC-Ⅱ合成的影响不明显。运动通过减少COL-Ⅰ表达和合成来抑制骨骼肌的纤维化,向心运动作用比离心运动更加明显。在损伤修复早期,COL-Ⅲ水平提高,使骨骼肌具备一定的强度和力学稳定性,有利于损伤后功能的快速代偿,而后期COL-Ⅲ水平持续增高可能促进和延长骨骼肌的纤维化过程。

大鼠骨骼肌急性拉伤修复过程中MHC-Ⅱ和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ变化的研究

目的:通过研究大鼠骨骼肌急性拉伤修复过程中MHC-Ⅱ和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的变化,了解拉伤愈合过程中肌纤维再生过程及纤维化过程。方法:将56只SD大鼠分为对照组、即刻组、第1、2、3、4、5周组,造成腓肠肌急性拉伤模型后对各组进行取材并检测MHC-Ⅱ和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ。结果:MHC-Ⅱ水平第1周降到最低,第2周开始增加,第3周恢复正常;Col-Ⅰ水平第1周降到最低,随后逐渐增加,在第3周超过正常,持续到第5周;Col-Ⅲ从第1周开始上升,第3周达到峰值,随后逐渐下降。结论:骨骼肌急性拉伤后,骨骼肌的再生过程约在损伤1周后开始,伤后3周达到高峰,并持续5周以上。纤维化过程在损伤后1周以内开始,并持续到5周以后。其中Col-Ⅲ的水平恢复早;Col-Ⅰ的恢复较晚,但在高水平维持时间更长。

白来航鸡MHC-Ⅰ重链基因克隆与序列分析

参照GenBank发表的鸡MHC-Ⅰ重链（BF2）基因序列,设计并合成1对引物,无菌采取纯系来航SPF鸡抗凝静脉血,直接提取总RNA,采用RT-PCR技术,PCR扩增BF2基因,并进行克隆和序列测定。测序结果表明,获得了来航鸡BF2基因,其大小为1 035 bp,包含一个完整阅读框,共编码345个氨基酸。与GenBank上鸡BF2基因序列进行比较,其核苷酸同源性在93.0%~97.6%之间,氨基酸同源性在83.2%~97.1%之间。来航鸡与人和其他种动物的MHC-Ⅰ重链基因核苷酸同源性在12.9%~83.6%之间。

MHC-Ⅰ类链相关基因A修饰的口腔鳞癌细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的:研究MHC-Ⅰ类链相关基因A(MHC classⅠchain-related gene A,MICA)修饰的口腔鳞癌疫苗诱导机体抗肿瘤免疫应答的有效性并探讨其作用机制。方法:灭活稳定转染MICA基因的口腔鳞癌细胞,制备成肿瘤疫苗,通过腹腔注射严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)鼠,观察其对皮下移植瘤生长的抑制作用;应用流式细胞术和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放法检测免疫重建荷瘤SCID鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和脾细胞表面NKG2D的表达及对肿瘤靶细胞的杀伤活性。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理。结果:转染MICA基因的口腔鳞癌疫苗能显著抑制免疫重建荷瘤SCID鼠皮下移植瘤的生长,上调PBMC和脾细胞表面NKG2D的表达,并增强对肿瘤靶细胞的杀伤活性,与未转染组及转染空白载体组比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:过表达MICA蛋白的口腔鳞癌疫苗能显著增强机体的抗肿瘤免疫应答能力,MICA有望作为口腔鳞癌免疫基因治疗的潜在靶标。

鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中登录（登录号：AB115244）的鸭MHC-Ⅰα链序列设计并合成1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中克隆出鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因,并进行T-A克隆和序列测定。结果表明,所获得的鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因长909bp,编码303个氨基酸的多肽,含一个完整的鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因。序列比较发现,鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因与GenBank登录的其它品种的鸭MHC-Ⅰα链核苷酸同源性为89.4%～91.0%,与人和其他动物的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的氨基酸同源性为11.1%～79.3%,表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的成功克隆为进一步研究鸭MHC-Ⅰ基因表达、生物学活性和应用奠定基础。

HBV对IFN-α受体表达及IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对干扰素α(IFN-α)受体表达的影响,以及对IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性的影响。方法以HepG2.2.15细胞、HepG2细胞及LO2细胞为细胞模型,采用流式细胞术、Western-blot检测IFN-αR1和IFN-αR2受体的表达;采用Western-blot动态分析IFN-α2b刺激肝细胞核蛋白STAT1的活化;流式细胞术检测IFN-α2b刺激肝细胞MHC-Ⅰ的水平。结果流式细胞术、Western-blot法检测结果显示,HepG2和LO2细胞中IFN-αR1和IFN-αR2受体及蛋白表达均显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,HepG2、LO2细胞中核蛋白p-STAT1的表达显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,MHC-Ⅰ水平在HepG2、LO2细胞中的表达较HepG2.2.15细胞更高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HBV的持续存在可降低IFN-αR1和IFN-αR2表达,并降低IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性,推测其可能是导致HBV对IFN-α产生耐药的部分机制。

分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制。方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组)。分别感染BALB/c小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞。分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数。结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17%。单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P<0.01)。结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低。

MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类基因转移诱导移植免疫耐受的研究

骨髓移植(包括造血干细胞移植)是治疗恶性血液病、放射病、难治性再障的一个有效治疗手段,但由于MHC(主要组织相容性复合物体)障碍,免疫排斥及GVHR仍然是移植相关死亡的主要原因.大量临床资料、统计报告已明确MHC基因在移植免疫排斥反应和移植物抗宿主反应(GVHR)中起关键作用.

大鼠MHC-Ⅰ类基因cDNA的克隆与鉴定

采用逆转录聚合酶链反应（PCR）技术自SD大鼠肝细胞中克隆出全长1125个bP的编码主要组织相容性抗原Ⅰ类复合体分子（MHC－Ⅰ）cDNA。经限制性内切酶图谱分析证实后，定向插人表达载体pBV220，并筛选出带有插人片断的阳性克隆。为研究在原核或真核表达系统中的表达，及其在抗原识别，免疫应答中的作用奠定了基础。