抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞MHCC-97H迁移的影响及相关机制

目的探讨通过RNA干扰抑制泛素样含PHD和环指域1(UHRF1)基因表达对肝癌MHCC-97H细胞迁移的影响及可能机制。方法合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-sh UHRF1(以空载体慢病毒LV-sh NC作为阴性对照),并将其感染MHCC-97H细胞。实时荧光定量PCR法检测UHRF1 mRNA在MHCC-97H细胞中表达情况,蛋白质印迹法检测UHRF1、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况,Transwell法检测MHCC-97H细胞迁移能力。结果 LV-sh UHRF1组UHRF1mRNA和蛋白表达量及MMP-9、VEGF蛋白表达量均明显低于LV-sh NC组(P均<0.05),迁移细胞数明显少于LV-sh NC组(P<0.05)。结论通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的迁移能力,机制可能与影响MMP-9和VEGF的表达有关。

鳖甲煎丸调控EGFR/MAPK/ERK通路对MHCC-97H肝癌细胞的影响

目的 探讨鳖甲煎丸通过miR-885-5p对表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的靶向调控对MHCC-97H肝癌细胞的影响及作用机制。方法 SPF级SD大鼠10只随意分为空白组和鳖甲煎丸(1.1 g/kg)组,制备空白及鳖甲煎丸含药血清。取对数生长期的MHCC-97H细胞,分为模型组、不同质量分数(5%、10%、15%、20%)空白血清梯度组和鳖甲煎丸含药血清梯度组,以及不含细胞的空白组。CCK-8法检测细胞增殖,筛选含药血清最佳干预时间及质量分数。将MHCC-97H细胞分为空白对照组(不做任何处理)、鳖甲煎丸含药血清组(20%鳖甲煎丸含药血清)、miR-885-5p mimics组(转染miR-885-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-885-5p阴性对照物)、鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组(20%鳖甲煎丸含药血清和转染miR-885-5p mimics),各组细胞均培养72 h。采用双荧光素酶报告实验验证miR-885-5p与EGFR的靶向关系。CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,Annexin V-APC/PI双染色法检测细胞凋亡水平,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-885-5p、EGFR、MAPK的激酶(MEK)、ERK1、ERK2 mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测EGFR、磷酸化的EGFR(p-EGFR)、MEK、磷酸化的MEK(p-MEK)、ERK1、ERK2、磷酸化的ERK1(p-ERK1)、磷酸化的ERK2(p-ERK2)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白表达;通过皮下注射法建立裸鼠MHCC-97H肝癌细胞皮下瘤模型,观察不同剂量鳖甲煎丸(0.55、1.1、2.2 g/kg)对裸鼠肝癌皮下瘤的抑制效果。结果 筛选出鳖甲煎丸含药血清最佳干预质量分数及时间为20%、72 h,同时,双荧光素酶报告实验显示,miR-885-5p可以直接靶向结合EGFR;各项实验报告显示空白对照组和miR-NC组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较,鳖甲煎丸含药血清组、miR-885-5p mimics组和鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组MHCC-97H肝癌细胞增殖率明显降低(P<0.01),迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05,P<0.01),同时,与细胞增殖、侵袭密切相关的蛋白CyclinD1和MMP1的蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),晚期凋亡率和总凋亡率均明显升高,促进细胞凋亡(P<0.01);鳖甲煎丸含药血清组、miR-885-5p mimics组和鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组明显上调miR-885-5p mRNA(P<0.01),抑制EGFR、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制EGFR、MEK、ERK1、ERK2磷酸化激活(P<0.01),其中,鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组效果最好(P<0.05,P<0.01)。裸鼠肝癌皮下瘤模型验证了鳖甲煎丸可抑制裸鼠肝癌皮下瘤生长。结论 鳖甲煎丸可促进MHCC-97H肝癌细胞凋亡,抑制其增殖、侵袭和迁移,其作用机制可能和通过miR-885-5p靶向调控EGFR/MAPK/ERK信号通路有关。

抑制UHRF1基因表达对肝癌细胞生物学行为的影响

目的探讨抑制泛素样含PHD和环指域1[ubiquitin-like with plant homeodomain(PHD)and ringfinger domains 1,UHRF1]基因表达对肝癌MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡的影响。方法合成UHRF1基因特异性小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),构建稳定干扰UHRF1基因表达的重组慢病毒LV-shUHRF1作为LV-shUHRF1组,并将其感染MHCC-97H细胞;以空载体慢病毒LV-shNC作为阴性对照组即LV-shNC组。采用蛋白质印迹法检测UHRF1蛋白在MHCC-97H细胞中表达情况,采用CCK-8法和流式细胞术检测2组MHCC-97H细胞增殖、周期分布和凋亡情况。结果蛋白质印迹法显示,LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达量为0.018±0.010,LV-shNC组细胞UHRF1蛋白表达量为0.818±0.031,LV-shUHRF1组细胞UHRF1蛋白表达水平明显低于LV-shNC组(P<0.05)。LV-shUHRF1组细胞的增殖能力明显低于LV-shNC组(P<0.05),G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率明显高于LV-shNC组(P均<0.05),S期细胞比例明显低于LV-shNC组(P<0.05)。结论通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制UHRF1的表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,抑制肝癌的发生和发展。

健脾益气方含药血清通过Caspase-3/Vimentin促进人肝癌MHCC-97H细胞凋亡

目的:观察健脾益气方含药血清对人MHCC-97H肝癌细胞凋亡的影响,探讨凋亡过程中波形蛋白(Vimentin)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的变化及其意义。方法:采用血清药理学方法,并结合Vimentin裂解剂和Caspase抑制剂,观察7.5%,15%,30%体积浓度健脾益气方含药血清干预对肝癌细胞增殖、侵袭、凋亡,及Vimentin,Caspase-3,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)蛋白表达的影响。结果:健脾益气方中、高剂量含药血清均可以降低MHCC-97H肝癌细胞中Vimentin蛋白表达(P<0.01),其下调程度与肝癌细胞的增殖抑制率、侵袭抑制率和凋亡率趋势一致;Vimentin裂解组细胞增殖抑制率、侵袭抑制率和凋亡率在各组中均最高;Caspase抑制组细胞的增殖抑制率、侵袭抑制率和凋亡率在各组中均最低。与空白血清组比较,健脾益气方中、高剂量组,Vimentin裂解组Caspase-3蛋白表达上调(P<0.01),Vimentin,PARP-1蛋白表达下调(P<0.01),且PARP-1蛋白出现了裂解片段;Caspase抑制组Caspase-3表达下调(P<0.01),Vimentin,PARP-1蛋白表达无统计学差异,PARP-1无蛋白裂解片段出现。结论:15%的健脾益气方含药血清对人肝癌细胞MHCC-97H的干预效果最佳,可能通过Caspase-3下调细胞中Vimentin蛋白表达,抑制肝癌细胞的增殖与侵袭;同时可能利用Caspase-3/Vimentin形成的正反馈促凋亡信号诱导肝癌细胞发生凋亡。

FBXW7/MCM7信号轴介导肝癌细胞增殖的研究

目的 探讨FBXW7靶向调控MCM7表达对肝癌细胞增殖的影响。方法 采用免疫共沉淀法(CoIP)和免疫荧光染色法(IF),分析肝癌细胞系MHCC-97H中FBXW7与MCM7的互作关系;通过慢病毒感染过表达FBXW7和(或) MCM7,小干扰RNA技术下调FBXW7和(或) MCM7的表达;采用Western blot检测FBXW7对MCM7蛋白表达的影响,CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖活性,EdU细胞增殖检测分析肝癌细胞的增殖能力,平板克隆实验分析肝癌细胞的集落形成能力。结果 在MHCC-97H细胞中,FBXW7与MCM7存在互作关系:过表达FBXW7抑制了MCM7的蛋白表达水平、并抑制了肝癌MHCC-97H细胞的增殖(P <0.05),在过表达FBXW7的基础上增加MCM7的表达后,细胞增殖能力提高(P <0.05);下调FBXW7后细胞中MCM7表达增加、细胞增殖能力增强(P <0.05),而下调FBXW7的同时干扰MCM7表达后,细胞增殖能力减弱(P <0.05)。结论 FBXW7能抑制肝癌细胞增殖,其机制与负向调节肝癌细胞中促癌蛋白MCM7的表达水平有关。

红花黄色素对人肝癌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的:探讨红花黄色素(safflor yellow,SY)对MHCC-97H细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法:选用MHCC-97H细胞体外培养至对数生长期,加入不同浓度SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L)进行体外培养,并设顺铂阳性对照组(终浓度0.5μg/ml),分别干预24 h、48 h及72 h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察SY对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪观察细胞周期及凋亡率的变化,Western–blotting检测Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果:MTT显示SY对人肝癌细胞MHCC-97H增殖有一定的抑制作用,与SY浓度及作用时间有相关性;流式细胞术显示,细胞凋亡率随SY浓度增加有上升趋势,细胞周期无明显变化;Western-blotting显示,随着SY浓度的增加,Bax表达增加,Bcl-2表达减少,而Bcl-2/bax比值下降。结论:SY对MHCC-97H细胞的生长有一定的抑制作用,但对细胞周期无明显阻滞作用,其可诱导该细胞凋亡,下调Bcl-2/Bax比值,可能为其促凋亡机制之一。

下调EMS1/cortactin对人高转移潜能肝癌细胞株迁移和内吞的影响

目的观察下调人高转移潜能肝癌细胞株(MHCC-97H)中EMS1/cortactin对细胞迁移和内吞的影响,探讨EMS1/cortac-tin在细胞内可能存在的功能。方法构建靶向EMS1的shRNA真核表达质粒(EMS1-PSilencer4.1-GFP-shRNA,EMS1-shR-NA);通过Lipofectamine 2000处理后将EMS1-shRNA转染MHCC-97H细胞,免疫荧光显微镜下观察转染效率;采用RT-qPCR和Westen blot分别检测EMS1 mRNA和cortactin蛋白表达水平;利用划痕、Transwell小室实验、转铁蛋白(transferrin,Tfn)内吞实验分别研究细胞迁移和内吞作用。结果成功构建EMS1-shRNA。免疫荧光显微镜下见转染细胞中明显的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),荧光强度在48 h达到峰值,其转染效率达84.76%。与未处理组相比,转染EMS1-shRNA细胞中EMS1 mRNA水平下降至19.00%,cortactin蛋白水平下降至36.74%、细胞相对迁移距离下降至55.52%、相对穿膜细胞数下降至27.79%、细胞内吞荧光标记Tfn水平显著减弱(P均<0.05)。结论下调EMS1/cortactin后,MHCC-97H细胞迁移、内吞能力明显下降,提示EMS1/cortactin与原发性肝癌(primary human heptatocellular,HCC)转移的生物学行为有关。