小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 :构建小鼠趋化因子 MIP1-α(m MIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达 ,为肝癌基因治疗提供实验基础。 方法 :PCR扩增含有 m MIP1-α的质粒 ,将腺病毒骨架质粒 p Ad Easy- 1以及线性化的重组穿梭质粒 p Track- CMV-m MIP1-α共转化 BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的包装、扩增和纯化后 ,感染小鼠肝癌细胞株 Hepa1- 6 ,一步法提取细胞总 RNA,RT- PCR检测 m MIP1-α的 m RNA。琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中 m MIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性。 结果 :得到了携带 m MIP1-α的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 1 1 efu/ ml,在感染后的 Hepa1- 6细胞中检测到 m MIP1-α的表达 ,上清中 m MIP1-α的趋化指数为 6 .3。结论 :成功地构建了携带 m MIP1-α的重组腺病毒载体 ,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础。

Tuftsin衍生物TP影响肿瘤相关巨噬细胞MIP-1α分子表达

目的探讨TP对肿瘤相关的趋化因子巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)表达的影响。方法使用RT-PCR的试验方法,检测小鼠巨噬细胞Ana-1细胞和肿瘤组织中提取的巨噬细胞中MIP-1α的表达;建立小鼠S180肉瘤细胞皮下移植瘤双瘤模型,待肿瘤体积生长至约250 mm3时,将其中一侧建立术后残瘤模型,并开始以8 mg·kg-1剂量的TP给药,隔天1次,给药4次后,分离肿瘤组织,免疫组化检测MIP-1α的表达。结果不同浓度TP对小鼠TAMs的MIP-1α表达较空白对照组明显减少,并呈剂量依赖性;体内试验中,TP处理组的荷瘤小鼠的肿瘤组织MIP-1α与对照组相比表达明显降低,接近于阳性药环磷酰胺组;但是MIP-1α在小鼠Ana-1细胞和TAMs中的mRNA表达量差异没有统计学意义;不同浓度TP对小鼠Ana-1细胞的MIP-1α表达差异也没有统计学意义。结论 TP不能影响小鼠Ana-1细胞系的MIP-1α表达,但TP对肿瘤组织中的巨噬细胞MIP-1α的表达有明显影响;MIP-1α有可能是TP抗癌作用机制的新靶点。

MIP-1α诱导Jurkat细胞穿过人脑微血管内皮细胞单层能力分析

本研究为探究人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞脑转移发生中枢神经系统白血病的机制及MIP-1α在T-ALL模式细胞Jurkat穿过人脑微血管内皮细胞(HBMEC)过程中的作用。应用real-time PCR、siRNA试验、跨内皮迁移试验和细胞黏附试验,分别检测MIP-1α的表达、Jurkat细胞穿透能力、迁移能力和黏附力。结果表明,Jurkat细胞作为研究T-ALL细胞穿过血脑屏障(BBB)机制的模式细胞MIP-1α表达均高于正常人T淋巴细胞以及其他3种T-ALL细胞系(HSB2、CEM、SUP-T1),Jurkat细胞分泌的MIP-1α使其穿过HBMEC单层能力增强。MIP-1αsiRNA干扰后的Jurkat细胞对HBMEC黏附和跨内皮迁移力下降。结论:Jurkat细胞分泌的MIP-1α参与了Jurkat细胞穿过HBMEC单层的过程。

MIP-1α和MMP-9在鼻息肉中的表达及其临床意义

目的:检测鼻息肉患者中MIP-1α和MMP-9的表达情况及其在鼻息肉发生发展中的作用及意义。方法:选择40例鼻息肉患者的鼻息肉组织和20例鼻中隔偏曲患者需要部分切除的下鼻甲黏膜组织,采用免疫组织化学技术检测鼻息肉组织和下鼻甲组织中MIP-1α和MMP-9的表达情况并进行相关性分析,同时光镜下观察分析两组标本的组织病理学特征。结果:鼻息肉组织中MIP-1α和MMP-9的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。在病例组MIP-1α水平与MMP-9成正相关。结论:MIP-1α和MMP-9在鼻息肉中的高表达,提示两者可能参与了鼻息肉的发病。

PSGL-1基因敲除小鼠血中MIP-1γ和TNF-α的表达

目的研究PSGL-1缺失对遗传基因工程小鼠外周血血常规的影响,并检测外周血中炎症因子IGFBP-6、TNF-α和MIP-1γmRNA表达水平。方法用血常规检测方法检测正常C57/BL/6小鼠和PSGL-1基因缺失的基因工程小鼠(PSGL-1-/-小鼠)的外周血中血常规的差异;其次,提取两种鼠的血液的mRNA,逆转录为cDNA,采用real-time PCR方法,检测C57小鼠与PSGL-1-/-小鼠外周血中炎症因子TNF-α和MIP-1γmRNA的差异。结果与对照组C57小鼠相比,PSGL-1-/-基因工程小鼠在12周龄时外周血中中性粒细胞(*P<0.05)、淋巴细胞(**P<0.01)和白细胞细胞(***P<0.001)总数显著增加炎症因子TNF-α以及MIP-1γ表达增加(P<0.05)。结论 PSGL-1的缺失改变了小鼠细胞因子并影响了外周血的血细胞组成,MIP-1γ和TNF-α炎症因子上调,有可能影响了小鼠的免疫功能。

精浆中MIP-1α与TNF-α测定的临床意义

目的:观察巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量在男性不育患者精浆中的变化,以及对精子的影响。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)与放射免疫分析(RIA)方法分别对110例不育男性和30例生育男性精浆MIP-1α与TNF-α含量进行测定,并与精液中精子浓度、活力、活动率、白细胞含量和血液中抗精子抗体(AsAb)情况进行对比分析。结果:不育症组精浆MIP-1α与TNF-α含量[(179.45±24.54)pg/ml和(4.66±2.01)ng/ml]均明显高于生育组[分别为(89.64±13.27)pg/ml和(2.90±1.23)ng/ml],两者之间均存在显著性差异(P<0.01),而且以少精子症不育症组最为显著。精浆MIP-1α与TNF-α含量在不育症组的精子活力不良组[(196.04±23.54)pg/ml和(5.31±2.47)ng/ml]、活动率下降组[(210.39±21.43)pg/ml和(5.14±2.61)ng/ml]、WBC精液组[(203.14±24.65)pg/ml和(5.28±2.66)ng/ml]和血清AsAb阳性组[(234.05±27.60)pg/ml和(5.63±2.31)ng/ml]中均分别高于精子活力正常组[(154.22±26.38)pg/ml和(3.94±2.09)ng/ml]、活动率正常组[(139.87±27.62)pg/ml和(4.11±2.26)ng/ml]、非WBC精液组[(155.76±21.42)pg/ml和(4.04±2.24)ng/ml]和血清AsAb阴性组[(124.85±23.56)pg/ml和(3.69±2.15)ng/ml],两者之间均存在显著性差异(P<0.05或P<0.01),而且均以血清AsAb阳性组增高最为显著。结论:精浆MIP-1α与TNF-α含量与精子数量和功能之间密切相关,检测精浆MIP-1α与TNF-α含量可以判断男性不育症患者的状态,帮助临床进行有价值的治疗。

巨噬细胞相关细胞因子在红斑狼疮患者血清中的表达及意义

目的研究巨噬细胞相关的细胞因子在不同类型红斑狼疮患者外周血中的表达及其意义。方法采用ELISA测定15例盘状红斑狼疮(DLE)、34例亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)、47例系统性红斑狼疮患者(SLE)及17例正常对照者血清中IL-18、MIF、MIP1-α水平,比较四组间的差异并分析与临床的相关性。结果 3种类型的红斑狼疮患者血清中IL-18、MIF、MIP1-α的表达水平均与正常相比差异显著(P<0.001),且不同类型间存在显著差异(P<0.05);SLE患者尿蛋白≥500mg/24hr、疾病活动度评分≥8分,ANA滴度≥1:320以及激素治疗前后血清中IL-18水平显著升高(P<0.05),且与SLE患者激素治疗剂量及呈显著负相关(r=-0.465,P=0.002)。结论巨噬细胞相关细胞因子参与红斑狼疮炎症形成过程,其中IL-18可反映SLE病情轻重及对激素治疗的反应。

p53对TGEV感染PK-15细胞4种免疫调节因子mRNA转录水平的影响

为探究p53对IFN-α、MIP-1α、PGK-1、TGF-β1四种免疫调节因子在TGEV感染PK-15细胞中的影响,本研究首先采用CRISPR-Cas9慢病毒系统靶向于PK-15细胞的p53基因构建p53基因敲除(p53-/-)的细胞;再以感染复数为0.1 MOI的TGEV感染p53野生型(p53+/+)和p53-/-PK-15细胞,于不同的感染时间收集细胞并提取细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测四种细胞因子的转录水平。结果表明,构建的靶向于p53基因敲除的PK-15细胞中,p53基因的454碱基位点缺失一个碱基T,细胞的p53蛋白已检测不到;TGEV感染后IFN-αmRNA的相对表达量在两种细胞中均表现为先上升后下降的趋势,但在病毒感染的36 h之前,p53-/-PK-15细胞中的表达量显著低于p53+/+PK-15细胞(p<0.05);MIP-1αmRNA相对表达量随着病毒感染时间的推移而递增,且在p53+/+PK-15细胞中显著高于p53-/-PK-15细胞(p<0.05);TGF-β1 mRNA的相对表达量在p53+/+PK-15细胞中随时间推移总体呈递减趋势,并在病毒感染(post infection,p.i.)12 h之后显著低于p53-/-PK-15细胞(p<0.05);PGK-1 mRNA相对表达量在病毒感染的12 h p53+/+PK-15细胞中虽略有上升,但差异不显著,而在p53-/-PK-15细胞中呈现时间依赖性递增,并显著高于p53+/+PK-15细胞(p<0.05)。以上结果表明:p53对TGEV感染PK-15细胞后的细胞免疫因子起到了关键的调节作用,推测其可能在宿主抗TGEV感染中发挥着重要作用。

腺病毒转染黑色素瘤抗原基因3的树突状细胞疫苗抗胃癌的免疫效应

目的研究趋化因子巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）动员的树突状细胞（DC），经黑色素瘤抗原基因3（MAGE-3）腺病毒转染后对胃癌细胞的免疫效应。方法615小鼠尾静脉注射MIP-1α，分选得到B220^-CD11c^＋细胞，加入细胞因子连续培养，检测其细胞表面标志和混合淋巴细胞反应（MLR）。收集培养后的B220^-CD11c^＋细胞，加入编码MAGE-3的重组腺病毒进行转染，制备表达肿瘤抗原的DC疫苗，以荷载小鼠前胃癌（MFC）全肿瘤细胞抗原制备的DC疫苗作为阳性对照。采用二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法，检测活化的T淋巴细胞在体外对MFC细胞的杀伤作用。采用酶联免疫吸附试验（ELISA），检测γ干扰素（INF-γ）的分泌情况。DC疫苗皮下注射MFC荷瘤小鼠，观察小鼠瘤体生长情况和存活时间。结果MIP-1α注射后，外周血中B220-CD11c^＋细胞明显升高。新鲜分离的B220-CD11c^＋细胞在体外经过细胞因子诱导分化后具有典型的DC表面标志，并在MLR中具有极强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。腺病毒转染MAGE-3的DC激活的T淋巴细胞表现出对MFC细胞的特异性杀伤作用，产生高水平的INF-γ[（1460．00±16．82）pg／ml]。实验组荷瘤小鼠接受DC疫苗治疗后，肿瘤生长缓慢，观察至MFC细胞接种后的第27天，其肿瘤体积仅为（3．46±1．12）cm^3；实验组小鼠的肿瘤体积与对照组之间的差异有统计学意义（P〈0．01）。实验组小鼠存活时间明显延长，与对照组之间的差异有统计学意义（P〈0．01）。结论注射趋化因子MIP—1α可快速动员并诱导分化为成熟DC。肿瘤抗原基因MAGE-3经腺病毒转染制备的DC疫苗，在体外可以诱导出针对胃癌细胞的特异性杀伤作用，在体内对MFC荷瘤小鼠有明显的免疫治疗作用。

NFκB抑制剂对白细胞介导肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨大鼠肝脏缺血再灌注后核因子κB (NFκB)抑制剂对炎性介质表达和中性粒细胞浸润集聚的影响。方法 建立大鼠肝脏部分热缺血模型 ,实验组于缺血前 15min腹腔注射NFκB抑制剂脯氨酸二硫代氨基甲酸酯 (ProDTC 15mg/kg体重 ) ,对照组等量生理盐水注射。结果 再灌注 3h ,对照组NFκBP6 5达高峰 ,持续至 6h ;肿瘤坏死因子 α(TNF α)、巨噬细胞炎性蛋白 2(MIP 2 )、细胞间黏附分子 1(ICAM 1)mRNA表达和蛋白表达明显增强 ;再灌注 12h髓过氧化物酶(MPO)活性明显增高。应用ProDTC者 ,NFκBP6 5含量、TNF α、MIP 2、ICAM 1mRNA和蛋白表达量、MPO活性均降低 (P <0 0 5 )。再灌注 6hProDTC组也显著降低了天门冬氨酸转氨酶 (AST)、丙氨酸转氨酶 (ALT)、乳酸脱氢酶 (LDH)、W/D水平 ,和对照组相比差异显著 (P <0 0 5 )。结论 缺血再灌注后NFκB活化上调了炎性介质表达从而增加中性粒细胞浸润 。