let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减少脑出血大鼠神经元调亡

目的:研究微小RNA let-7a对脑出血(ICH)大鼠神经元凋亡的影响及其分子机制。方法:从48只健康SD大鼠中随机选取8只作为假手术组,将2μLⅦ型胶原酶注入其余大鼠苍白球以构建ICH模型。将造模后的大鼠随机分为模型(2μL生理盐水)组、let-7a激动剂(agomir)组、阴性对照(NC)agomir组、let-7a拮抗剂(antagomir)组和NC antagomir组,每组8只,在侧脑室注射相应药物。7 d后进行神经功能评分;HE染色观察病理损伤;RT-qPCR和Western blot检测相关蛋白表达水平;TUNEL染色检测神经元凋亡情况;利用生物信息学软件预测let-7a与丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)的靶向关系,并在HEK293T细胞中用双萤光素酶报告基因实验进一步验证。结果:动物实验中,let-7a过表达时,神经功能评分降低,病理损伤减轻,胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)低表达,神经元凋亡减少,cleaved caspase-3和cleaved PARP低表达(P<0. 05)。细胞实验中,MAP4K3是let-7a的靶基因之一,且两者为负向调控;let-7a过表达抑制MAP4K3/MKK4/JNK的表达。结论:let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路,减少ICH大鼠神经元凋亡。

MKK4基因在喉鳞癌中的表达及其临床意义

目的:研究丝裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测42例喉鳞癌、20例喉乳头状瘤及20例声带息肉组织中MKK4 mRNA和蛋白的表达,分析其与喉鳞癌临床病理参数之间的关系。结果:MKK4 mRNA和蛋白表达的阳性率在喉鳞癌、喉乳头状瘤及声带息肉组织中逐渐降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。MKK4 mRNA和蛋白的表达随喉鳞癌的浸润深度增加而上升(P<0.05),在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组(P<0.05),在临床Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达高于临床Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)。MKK4的表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及组织学分级无相关性(P>0.05)。结论:MKK4 mRNA和蛋白在喉鳞癌组织中的表达上调可能与喉鳞癌的发生及浸润转移有关,MKK4可能成为一个潜在的判断喉鳞癌发生与转移的观测指标。

鼻咽癌MKK4蛋白表达与-1044A/T多态性的相关性分析

目的:探讨鼻咽癌组织中MKK4蛋白的表达与-1044A/T多态性的相关性。方法:90例鼻咽癌患者,运用免疫组化法测定MKK4蛋白的表达,以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测其基因-1044A/T位点单核苷酸多态性。结果:鼻咽癌组织中MKK4蛋白表达(-)为24.4%(22/90),(+)为15.6%(14/90),(++)为34.4%(31/90),(+++)为25.6%(23/90)。低表达(-/+)患者共36例,-1044AA基因型占22例(61.11%),AT基因型占12例(33.33%),TT基因型占2例(5.56%),AT+TT基因型共占14例(38.89%);高表达患者共54例,其中AA基因型占38例(70.37%),AT基因型占15例(27.78%),TT基因型占1例(1.85%),AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表达与高表达发生T基因变异无统计学意义(Z=0.323,P=0.747)。结论:MKK4蛋白表达的高低与-1044A/T启动子基因多态性无明显相关性。

MKK4蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨MKK4蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化方法分别检测90例鼻咽癌组织和20例鼻咽慢性炎症组织中MKK4蛋白的表达情况,并分析与鼻咽癌临床病理特征的关系。结果:MKK4蛋白在鼻咽癌组织中阳性表达率为75.6%(68/90),鼻咽慢性炎症组织中阳性表达率为95.5%(19/20),差异有统计学意义(P<0.05)。MKK4蛋白在有淋巴结转移、分化程度较差的组织中的高表达率明显低于无淋巴结转移、分化程度相对较好的组织(P<0.05),但不同年龄、性别、原发部位、T分期并不影响MKK4蛋白的阳性高表达率,无统计学差异(P>0.05)。结论:MKK4在鼻咽癌组织中的表达明显低于鼻咽慢性炎症组织中的表达,差异具有统计学意义;MKK4蛋白在有淋巴结转移、分化程度较差和临床分期较晚的组织中的表达明显低于无淋巴结转移、分化程度较好及临床分期较早的组织,差异具有显著性;但年龄、性别、原发部位、T分期在鼻咽癌组织中MKK4蛋白的表达均无显著性差异。

EB病毒-MKK4基因遗传变异的交互作用与鼻咽癌危险性研究

目的:研究EB病毒感染与MKK4基因遗传变异的交互作用在鼻咽癌发病中的作用。方法:收集鼻咽癌病例和正常对照各500名,采用TAQMAN技术分析MKK4基因遗传变异-1304T>G与鼻咽癌发病的关联;并分析基因位点与EB病毒感染状态在鼻咽癌发生中的交互作用。结果:相对TT基因型携带者,G变异基因型鼻咽癌的发病风险下降(TG基因型adjustedOR=0.78,95%CI=0.61～0.94,P=0.02;GG基因型adjustedOR=0.64;95%CI=0.39～0.99;P=0.04),且存在显著的等位基因剂量—效应关联(Ptrend=0.02)。进一步交互作用分析发现EB病毒感染状态可改变G变异基因型降低鼻咽癌发病风险的作用(adjustedP交互作用=0.04)。结论:MKK4基因遗传变异可降低鼻咽癌的发病风险,但其对鼻咽癌的保护作用受EB病毒感染状态影响,提示EB病毒-MKK4基因交互作用可能是我国南方人群易患鼻咽癌的一个危险因素。

RAGE-MKK4/MKK7-JNK1通路在2型糖尿病合并肝细胞癌中的作用

目的探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)、丝裂原活化蛋白激酶激酶7(MKK7)及c-Jun氨基末端蛋白激酶1(JNK1)在2型糖尿病合并肝细胞癌中的表达及意义。方法收集肝胆外科手术切除的2型糖尿病合并肝细胞癌(DMHC组)癌组织和相应癌旁组织标本18例及30例肝细胞癌(HCC组)癌组织和相应癌旁组织,用Western blot法检测其RAGE、MKK4、MKK7及JNK1的蛋白表达情况。结果 (1)DMHC及HCC组癌组织中RAGE、MKK7及JNK1蛋白表达均较相应癌旁组织高,MKK4蛋白表达水平均较相应癌旁组织表达低,差异均有统计学意义(P<0.01)。DMHC组癌组织中MKK7和JNK1蛋白表达高于HCC组癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)HCC组低分化的癌组织RAGE、MKK7和JNK1蛋白表达水平均较高分化的癌组织高,而DMHC组低分化的癌组织MKK7和JNK1蛋白表达水平较高分化的癌组织表达高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)DMHC组发生转移的患者癌组织MKK4蛋白表达水平较未发生转移者降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)DMHC及HCC组癌组织RAGE与MKK7、RAGE与JNK1、MKK7与JNK1蛋白表达水平均呈显著正相关关系(P<0.05),且DMHC组的相关性更显著。结论 RAGE蛋白表达增加可能参与了肝细胞癌的发生和发展;MKK4降低可能是单纯肝细胞癌及2型糖尿病合并肝细胞癌的危险因素之一;糖尿病状态下MKK7、JNK1蛋白更高的表达可能促进了2型糖尿病时肝细胞癌的发生和发展,MKK4降低可能导致了肝癌细胞的转移。MKK7和JNK1可能在一定水平上受RAGE的调控。

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3′非编码区151 bp,5′非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。

MKK4基因启动子区-1044A>T多态与鼻咽癌易感性的研究

目的 探讨MKK4基因启动子区-1044A〉T位点单核苷酸多态基因型与散发性鼻咽癌遗传易感性的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）检测30例健康人和90例鼻咽癌患者的MKK4基因-1044A〉T位点（rs3809728）单核苷酸多态性。结果 MKK4基因-1044A〉T位点基因多态性在病例组和对照组中分布差异无统计学意义,AT基因型（OR=0.726,95%CI=0.333-2.151）,TT基因型（OR=0.952,95%CI=0.094-9.663）,P=0.712。结论 MKK4基因-1044A〉T位点的单核苷酸多态性：可能与散发性鼻咽癌易感性无关。

左归丸对庆大霉素诱导的肾损伤大鼠MKK4、MKK7、JNK的影响

目的:探讨左归丸对庆大霉素诱导的肾损伤大鼠MKK4、MKK7、JNK的影响。方法:将40只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、SP600125组、左归丸组,对照组给予腹腔注射0.9%生理盐水2.5ml·kg-1·d-1,模型组腹腔注射硫酸庆大霉素100ml·kg-1·d-1,SP600125组左侧腹腔注射硫酸庆大霉素100ml·kg-1·d-1,2h后右侧腹腔注射SP60012515ml·kg-1·d-1,左归丸组腹腔注射硫酸庆大霉素100ml·kg-1·d-1和灌胃左归丸水溶液2g·200g-1·d-1,4组大鼠连续给药10d。第11天测量各组大鼠尿NAG酶、血Scr、血BUN等生化指标;HE染色观察各种大鼠肾脏病理状况;以免疫组化技术检测各组大鼠肾脏MKK4、MKK7、JNK的表达,并采用Image pro-Plus6.0图像分析软件半定量分析;以Westernblot方法检测各组大鼠肾脏MKK4、MKK7、JNK蛋白的表达。结果:生化指标结果显示:与对照组比较,模型组的大鼠尿NAG酶、血Scr、血BUN值显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,SP600125组与左归丸组生化指标得到改善,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。免疫组化结果显示:与对照组比较,模型组MKK4、MKK7、JNK在肾小管大量表达,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,SP600125组与左归丸组表达少量,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Western blot方法结果显示:模型组MKK4、MKK7、JNK蛋白灰度值较对照组明显升高(P<0.01),SP600125组与左归丸组较模型组灰度值下降(P<0.05)。结论:左归丸对庆大霉素诱导肾损伤大鼠的保护作用可能与抑制MKK4、MKK7、JNK的表达有关。

滑膜细胞炎性因子水平及miR-145/MKK4分子轴的关联性

背景:炎症因子被证明在软骨细胞和双指关节细胞中表达异常,靶向炎症途径可能是治疗骨关节炎的有效策略,但目前鲜有关于滑膜细胞炎症反应的研究报道。目的:探讨~(99)Tc-MDP通过miR-145/MKK4分子轴对滑膜细胞产生炎性因子的影响。方法:①骨关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA细胞)经过不同质量浓度~(99)Tc-MDP药物处理48 h,qRT-PCR实验检测HFLS-RA细胞中miR-145以及炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达水平,CCK-8实验检测HFLS-RA细胞存活率;②确定~(99)Tc-MDP干预最佳质量浓度后,将HFLS-RA细胞分为4组:NC组(空白对照组,不经任何处理)、~(99)Tc-MDP组(13μg/L~(99)Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h)、~(99)TcMDP+miR-145 inhibitor组(13μg/L~(99)Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h同时在细胞中转染miR-145 inhibitor)、~(99)Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4组(13μg/L~(99)Tc-MDP处理HFLS-RA细胞48 h同时在细胞中转染miR-145 inhibitor+sh-MKK4),qRT-PCR实验检测HFLS-RA细胞中miR-145以及炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α的表达水平,CCK-8实验检测HFLS-RA细胞存活率。结果与结论:①~(99)Tc-MDP可显著抑制HFLS-RA细胞炎性因子caspase 1、白细胞介素1β、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α表达和细胞存活率,且半抑制浓度IC_(50)=13μg/L;②~(99)Tc-MDP可显著上调HFLS-RA细胞中miR-145的表达,下调MKK4表达(P<0.01);③miR-145靶向MKK4,且过表达miR-145可显著抑制MKK4的表达;④与~(99)Tc-MDP组相比,~(99)Tc-MDP+miR-145 inhibitor组可显著抑制HFLS-RA细胞中miR-145的表达(P <0.05),促进细胞中炎性因子的表达(P<0.05)和细胞增殖(P<0.05),相比较于~(99)Tc-MDP+miR-145 inhibitor+sh-MKK4组,~(99)Tc-MDP+miR-145 inhibitor组可明显促进HFLS-RA细胞增殖(P<0.05)和炎性因子的表达(P<0.05);⑤结果表明,~(99)Tc-MDP通过miR-145靶向下调MKK4抑制HFLS-RA细胞产生炎性因子,缓解骨关节炎发生。

MKK4在肿瘤发生发展中的作用

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在调控细胞凋亡、生长以及一些重要基因的表达中发挥重要作用[1]。现已经确认在哺乳动物中存在4条不同的MAPK通路：

mkk4基因启动子区多态性对结肠癌易感性的影响

目的通过检测结肠癌患者mkk4启动子区单核苷酸多态性位点及其与蛋白表达的关系,探讨mkk4基因多态性与结肠癌易感性的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术(PCR-rflp)分别检测120例结肠癌患者与120例健康对照组的mkk4基因这两处位点多态性,并用免疫组化的方法观察结肠癌组织的mkk4表达量。结果发现在rs3826392(T/G)位点结肠癌组携带G变异基因型(T/G+G/G)频率显著低于健康对照组(P=0.043,OR=0.576,95%CI=0.337～0.985);肿瘤组织中mkk4蛋白表达在G变异基因型中明显增高(P<0.001);rs3809728(A/T)则无统计学意义。结论 mkk4基因rs3826392(T/G)位点G变异与mkk4的表达增加和结肠癌的发病风险降低相关,是结肠癌发病的一个保护因素。而rs3809728(A/T)多态性则与散发性结直肠癌无明显相关。

MKK4启动子多态-1304T→G对结直肠癌辅助化疗预后的影响

目的：分析MKK4启动子多态rs3826392位点对结直肠癌辅助化疗预后的影响。方法：回顾性分析203例结直肠癌并接受FOLFOX6辅助化疗患者rs3826392基因型与临床病理因素、总生存（overall survival,OS）、无病生存（disease free survival,DFS）的相关性。结果 ：rs3826392基因型与临床病理因素无明显相关（P〉0.05）,TG＋GG基因型相对于TT基因型,有更好的OS（P=0.018）、DFS（P=0.019）。Cox多因素分析rs3826392TG＋GG基因型是影响OS（HR=0.389;95%CI=0.177~0.855）、DFS（HR=0.491;95%CI=0.271~0.890）的独立有利因素。结论：rs3826392变异基因型（TG＋GG）可以成为结直肠癌辅助化疗良好预后的生物标记。

siRNA介导的MKK4表达抑制研究

采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#64447、siRNA ID#64539和siRNA ID#186583)人工合成的MKK4基因特异的小分子干扰RNA(siRNA)分别导入小鼠成肌细胞C2C12中。实时荧光定量PCR结果表明,转染了siRNA ID#64447的细胞,其MKK4 mRNA的表达水平下调得最多,约为85%。试验获得了能够高效下调MKK4基因表达的siRNA。

依达拉奉对脑缺血/再灌注大鼠海马组织MKK4亚硝基化影响

目的研究依达拉奉对脑缺血/再灌注诱导大鼠海马组织MKK4亚硝基化影响,并分析其改变的可能机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组(sham)、脑缺血/再灌注组(I/R)、药物对照组(NS)和依达拉奉处理组(Ed)。Pulsinelli-Brierley四动脉结扎法建立大鼠I/R实验模型。MKK4亚硝基化检测:海马组织匀浆,蛋白样品用抗MKK4抗体作免疫沉淀,抗-SNO-Cys抗体作免疫印迹。结果 MKK4亚硝基化水平I/R组、NS组较sham组明显增加(P <0. 05),Ed组较NS组降低明显(P <0. 05),各组间MKK4蛋白表达差异无显著性(P> 0. 05)。结论依达拉奉可能通过抑制脑I/R诱导海马组织MKK4的巯基亚硝基化,减少其活化,调节JNK、p38 MAPK信号通路,保护神经元,减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

integrin α6和MKK4基因在卵巢癌不同淋巴结转移能力细胞系中的表达及其意义

目的:探讨integrin α6、MKK4基因在卵巢癌不同淋巴结转移能力细胞亚系的表达及其意义。方法:采用TRIZOL一步法抽提卵巢癌不同淋巴结转移能力细胞的总RNA,逆转录合成CDNA,应用RT-PCR技术检测integrin α6、MKK4基因在不同细胞亚系表达的灰度值,应用实时荧光定量PCR技术对integrin α6、MKK4基因在不同细胞亚系的表达进行定量分析。结果:integrin α6基因在SKOV3、SKOV3-PM2、SKOV3-PM3细胞系中的表达呈上升趋势,但在SKOV3-PM4细胞系中的表达低于SKOV3细胞系。MKK4基因表达量在SKOV3、SKOV3-PM2、SKOV3-PM3、SKOV3-PM4细胞系呈逐渐下降趋势。结论:integrin α6表达上调和MKK4表达下调与卵巢癌的淋巴结定向高转移过程密切相关,出现integrin α6在SKOV3-PM4细胞系表达的下调的现象,可能存在整合素各亚单位之间的相互调控。

中国明对虾MKK4基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达分析

为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为Fc MKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现Fc MKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达谱式,表明Fc MKK4可能参与中国明对虾非生物胁迫的应答反应。

斑节对虾MKK4基因的表达分析

从斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢组织cDNA文库中筛选并获得了斑节对虾MKK4基因的cDNA片段,然后采用荧光定量的方法研究了MKK4基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明,MKK4的mRNA在各组织中都有表达,其中在未成熟精巢中表达量最高,其次分别为雌、雄个体的肠。在精巢不同发育阶段,其在未成熟精巢的表达量极显著高于成熟精巢。对卵巢不同发育期的研究表明,从Ⅱ期开始,随着卵巢的发育,MKK4mRNA的表达量逐渐增加,到第Ⅵ期时表达量达到最高。而在Ⅰ期的表达量虽高于Ⅱ期和Ⅲ期、低于Ⅳ期,但其与其他3期均无显著差异。

MKK4蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与转移的关系

目的：研究丝裂原活化蛋白激酶激酶4（Mitogen-activated protein Kinase Kinase 4,MKK4）在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测口腔鳞状细胞癌原发灶及淋巴结转移灶中MKK4蛋白的表达。结果：45例口腔鳞状细胞癌原发灶组织中,有淋巴结转移组（25/45）的MKK4蛋白表达强度高于无淋巴结转移组（20/45）的表达强度（P〈0.01）;25例淋巴结转移灶的MKK4蛋白表达强度高于原发灶的表达强度（P〈0.05）;31例临床Ⅲ-Ⅳ期组MKK4蛋白表达强度高于14例临床Ⅰ-Ⅱ期组的表达强度（P〈0.01）;20例癌旁组织的表达强度显著低于45例口腔鳞状细胞癌组织的表达强度（P〈0.01）。MKK4蛋白表达与患者年龄、性别、部位、大小和组织学分化无关（P〉0.05）。结论：MKK4蛋白的表达上调与口腔鳞状细胞癌的浸润转移有关;MKK4蛋白可能在口腔鳞状细胞癌的浸润转移过程中发挥了促进的作用。

MKK4基因的抑癌及致癌作用

丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)基因为新近发现的肿瘤转移抑制基因。其编码蛋白可激活c-Jun氨基端激酶和p38这两条丝裂原活化蛋白激酶通路,将细胞外刺激信号转导至细胞核内,引起细胞的增殖、分化、转化及凋亡。MKK4基因具有抑癌作用,随着MKK4基因启动子区Rs3826392(T/G)位点G变异个数增加,结肠癌、肺癌及鼻咽癌的患病率会随之降低。与之相反,MKK4基因同时具有致癌作用,其表达上调可能与胰腺癌、前列腺癌的发生及浸润转移有关。