白血病相关抗原MLAA-34 HLA-A2^+限制性CTL表位的预测及鉴定

目的采用生物信息学方法预测和鉴定白血病相关抗原MLAA-34 HLA-A2+限制性CTL表位,探索基于MLAA-34为靶标的白血病免疫治疗的可能性。方法采用超基序法和量化基序法对靶抗原MLAA-34 HLA-A2+限制性CTL表位进行预测;选取评分较高且排位在前10位的抗原表位肽为候选表位肽,并进行人工合成。利用T2细胞,以肽结合试验及流式细胞术检测各候选CTL表位肽的结合亲和力[以荧光指数(fluorescence index,FI)表示];选取亲和力较高的4种多肽进行特异性CTLs的体外扩增,同时用LDH释放法对CTLs的活性进行检测。结果预测的前10位候选MLAA-34 CTL表位肽中,MLAA2(ILLKNQPKL)、MLAA3(LLTRHKVLV)、MLAA5(LLVTLI-ADL)和MLAA9(YLIKQIRDL)具有较高的亲和力,其FI分别为1.65、1.73、1.82、1.02,可作为候选表位肽进一步分析。细胞毒实验分析显示,MLAA5(LLVTLIADL)可在体外有效诱导特异性CTLs的产生,杀伤靶细胞。结论 MLAA5(LLVTLIADL)为白血病相关抗原MLAA-34的HLA-A2+限制性CTL表位,为基于MLAA-34的治疗性多肽疫苗的设计制备奠定了基础。

急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34启动子的克隆及其核心区鉴定

目的:克隆急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34上游启动子序列并检测其活性、鉴定核心区域。方法:PCR扩增MLAA-34基因启动子区全长片段,将其连接至p GL3-Basic载体,克隆重组质粒;构建一系列MLAA-34基因启动子5’侧翼区截短质粒;将含MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒转染至U937、HEK293细胞,应用双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:构建了含有MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒;与空载体相比,其启动子活性明显增加(P <0. 001)。MLAA-34最小活性区域位于转录起始位点-402 bp至-200 bp之间,其中包含E2F1,MZF-1,SP1,USF2和STAT3等多个转录因子结合位点。结论:成功构建急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒,鉴定出核心启动子区,其中含有多个潜在的转录因子结合序列。

白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中的抗凋亡作用

目的:研究白血病相关基因MLAA-34在He La细胞中的抗凋亡作用。方法:以HeLa细胞株为研究对象,构建MLAA-34重组慢病毒表达载体,建立了高表达MLAA-34的稳定转染Hela细胞株;应用As_2O_3诱导其凋亡,采用MTT法、平板克隆形成实验、流式细胞术分别检测细胞增殖能力、集落形成能力、凋亡及细胞周期分布的变化。结果:应用As_2O_3处理后,稳定转染MLAA-34的Hela细胞株的存活率明显高于对照组,其集落形成能力显著增加;MLAA-34基因高表达显著降低了HeLa细胞的凋亡率,同时相应的降低了G_2/M期细胞的比例。结论:白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中具有抑制As_2O_3诱导的凋亡作用。

急性单核细胞白血病新抗原MLAA-34基因突变的检测及其与疗效相关性的研究

目的:研究MLAA-34全外显子突变与白血病疗效的相关性。方法:对AML-M5组(40例)及健康对照组(5例),应用RT-PCR方法检测MLAA-34基因的表达水平,研究其对化疗疗效的影响。对该基因全部12个外显子进行测序,研究MLAA-34突变对M5患者OS和PFS的影响;分析白血病重要的5个预后基因突变与MLAA-34基因突变的相关性。结果:M5组MLAA-34基因表达显著高于正常对照组,高表达的患者化疗疗效差。E2外显子第59号碱基存在多态性,C59T位点突变的患者具有更高的MLAA-34基因表达。MLAA-34基因C59T位点突变与重要的分子标志基因FLT-3和DNMT3A的突变显著相关。结论:MLAA-34基因C59T位点突变为白血病复发的高危因素,并可成为一个白血病治疗的候选靶点。

新抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病患者的表达及意义

目的探讨白血病新肿瘤抗原基因MLAA-34在急性单核细胞白血病(AML-M5)初诊患者中的表达水平,分析其与临床特征及预后的关系。方法采用基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR方法检测MLAA-34在35例AML-M5患者、40例非AML-M5急性髓细胞白血病患者、12例非白血病的血液疾病患者骨髓标本以及10例健康志愿者(正常对照)外周血单个核细胞中的表达水平并进行比较。结果初治AML-M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较正常对照、非AML-M5白血病及非白血病疾病患者明显增高(P<0.05);完全缓解的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前明显下降(P<0.05),复发的M5患者MLAA-34 mRNA表达水平再次增高;对8例复发的AML-M5患者进行MLAA-34基因表达水平动态监测,发现复发前MLAA-34基因表达水平有上升趋势。结论 MLAA-34基因的过表达参与了急性单核细胞白血病的发病,在AML-M5中的表达具有较高的特异性,动态监测其表达水平在AML-M5的疗效评估、预后判断及复发预测方面具有一定的临床意义。

转录因子MZF-1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控研究

目的:探讨转录因子MZF-1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用。方法:利用双萤光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析MZF-1对MLAA-34基因启动子转录活性的影响。通过凝胶电泳迁移率变动检测(electrophoretic mobility slift assay,EMSA)和染色质免疫沉淀检测(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验,验证MZF-1是否与MLAA-34启动子核心区直接特异性结合。构建MZF-1真核表达载体和干涉载体,转染U937细胞,应用RT-PCR和Western blot法检测MLAA-34基因的转录和表达变化。结果:转录因子MZF-1对MLAA-34基因表达具有调控作用,MZF-1结合序列点突变后,相对荧光素酶活性降低(P<0.01)。EMSA和Ch IP实验从细胞内、外水平分别证明MZF-1可与MLAA-34启动子直接结合而发挥调控作用。在过表达试验中,MZF-1的增加可上调MLAA-34的表达(P<0.05);在干涉试验中,MZF-1的降低可下调MLAA-34的表达(P<0.05)。结论:转录因子MZF-1可与MLAA-34基因启动子上的转录调控区结合,并促进急性单核细胞白血病细胞中MLAA-34基因的转录。

转录因子E2F1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用

目的:探讨转录因子E2F1对急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34的转录调控作用。方法:利用双荧光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析E2F1对MLAA-34基因启动子转录活性的影响。通过凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,验证E2F1是否与MLAA-34启动子核心区直接特异性结合。构建E2F1真核表达载体和干涉载体,转染U937细胞,RT-PCR和Western Blot检测MLAA-34基因的转录和表达变化。结果:转录因子E2F1对MLAA-34基因表达具有调控作用,E2F1结合序列点突变后,相对荧光素酶活性升高(P<0.01),绿色荧光蛋白的表达增高。EMSA和ChIP实验,从细胞内、外水平分别证明E2F1可与MLAA-34启动子直接结合而发挥调控作用。在过表达试验中,E2F1的增加可下调MLAA-34的表达(P<0.05);在干涉试验中,E2F1的降低可上调MLAA-34的表达(P<0.05)。结论:转录因子E2F1可与MLAA-34基因启动子上的转录调控区结合,并抑制急性单核细胞白血病细胞中MLAA-34基因的转录。

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。

pIRES2-MLAA34-EGFP穿梭载体的构建及表达

目的构建p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,并对其进行原核诱导表达。方法用RT-PCR的方法从U937细胞中提取MLAA-34基因,利用酶切、T4连接等分子生物学技术将MLAA-34目的基因克隆至p IRES2-EGFP表达载体中,经PCR、酶切等技术对构建的重组表达载体p IRES2-MLAA34-EGFP进行鉴定后,转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果扩增出MLAA-34全长基因1 014 bp,构建了p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定,与预期大小一致。重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。结论成功构建了p IRES2-MLAA34-EGFP重组质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达。

核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的构建及其免疫活性观察

目的构建p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV核酸疫苗,并检测其免疫活性,探讨核酸疫苗抗白血病效应。方法采用重叠延伸PCR技术扩增急性白血病相关抗原基因MLAA34和负性共刺激分子B7H4的融合基因(MLAA34-B7H4IgV),并构建核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV。将28只BALB/c小鼠随机分为P、M、B、MB组各7只,分别在小鼠两侧股四头肌内侧肌内注射磷酸盐缓冲液p EGFPN1、p EGFPN1-MLAA34、p EGFPN1-B7H4IgV、p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV质粒100μg,在0、2、4周各行1次同剂量加强免疫;分别于0、4、8周眼球取血,8周取血后处死小鼠并摘取脾脏。ELISA法检测免疫8周血清中抗体Ig G1、Ig G2a以及免疫0、4、8周血清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,MMT法检测小鼠脾淋巴细胞对单核巨噬细胞THP-1的增殖抑制作用。结果 MLAA34-B7H4IgV融合基因PCR产物电泳检测约为2 000 bp,与理论值(1 922 bp)相符; p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV酶切后电泳检测为5 000~7 500 bp,与理论值(6 655 bp)相符。与同组免疫0周时、同时点P组比较,免疫4、8周时M、B、MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0. 05或<0. 01)。与同时点M、B组比较,MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0. 05); M、B组同时点比较,差异无统计学意义。免疫8周,MB组血清Ig G1水平高于其他各组(P均<0. 05),其他各组间差异均无统计学意义(P均> 0. 05);各组血清Ig G2a水平差异均无统计学意义(P均> 0. 05)。MB组THP-1细胞增殖抑制率高于同效靶比其他各组(P均<0. 05或<0. 01);效靶比为50∶1和25∶1时,M组和B组THP-1细胞增殖抑制率高于高于P组(P均<0. 05),两组之间无差异;效靶比为12. 5∶1时,B组THP-1细胞增殖抑制率高于M组、P组(P均<0. 05)。结论成功构建了核酸疫苗p EGFPN1-MLAA34-B7H4IgV,该疫苗激活了小鼠体内的细胞免疫和体液免疫,具有明显的抗白血病效应。

基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究

目的构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒,并检测其免疫效果。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法提取急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34和热休克蛋白(HSP)70基因,设计特异性重叠引物,以重叠延伸PCR(SOEPCR)技术扩增MLAA34-HSP70融合基因,构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70。将核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤作用及小鼠脾细胞悬液中白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平。结果扩增出MLAA34-HSP70融合基因2 956bp,成功构建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70,经鉴定与预期结果一致;脾淋巴细胞杀伤活性结果显示,核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70对U937细胞的杀伤效率明显高于其他实验组及对照组(P<0.01);核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70组细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明显高于其他实验组及对照组(P<0.01)。结论成功构建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗,该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答,对MLAA34阳性细胞具有特异性杀伤作用。