四引物扩增受阻突变体系分析少精、无精症患者白细胞MLH3基因C2531T突变

目的分析错配修复蛋白MLH3基因C2531T突变与少精、无精症的关系。方法以MLH3C2531T为例建立四引物扩增受阻突变体系(4P-ARMS-PCR)方法;分别用4P-ARMS-PCR和PCR-RFLP检测81例少精、无精症患者和80例正常对照者MLH3C2531T;随机抽取20%标本测序进行验证。结果MLH3C2531T的CT+TT基因型在患者中有明显的流行,且MLH3C2531T的T等位基因与疾病存在相关性(P<0.01);PCR-RFLP检测结果与4P-ARMS-PCR检测结果完全一致,测序结果相同。结论4P-ARMS-PCR可快速、简便、准确检测基因单核苷酸突变(SNP);错配修复蛋白MLH3C2531T多态性与少精、无精症存在相关性。

高分辨率熔解曲线技术在少精、无精症患者MLH3基因C2531T检测中的应用

目的探讨利用高分辨率熔解曲线(HRM)分析法检测少精、无精症患者MLH3 C2531T基因突变的可行性。方法分别用四引物扩增受阻突变体系和HRM分析法检测60例少精、无精症患者MLH3 C2531T基因突变的情况,并对2种检测方法进行比较,随机抽取30%标本测序验证。结果 HRM检测60例少精、无精症患者MLH3 C2531T C/C型39例,C/T型18例,T/T型3例,与四引物扩增受阻突变体系和测序结果一致。结论 HRM技术具有高灵敏度、高特异度、高准确率、低成本及简单方便的特点,适合在临床开展。

hMLH3基因2531位点多态性及环境因素与新疆哈萨克族食管癌家族食管癌发病的相关性研究

目的探讨hMLH3基因2531位点多态性及环境因素与新疆哈萨克族食管癌家族式高发率的关系。方法通过检测86例新疆哈萨克族食管癌家族成员及82例对照家族成员外周血hMLH3基因的多态性,并通过对环境危险因素进行现场问卷调查,研究hMLH3基因多态性和环境因素在新疆哈萨克族食管癌家族食管癌发病中所起的作用。结果新疆哈萨克族食管癌家族与对照家族hMLH3基因2531位点不同基因型的分布频率差异有统计意义(P=0.018);食管癌患者与非食管癌患者hMLH3基因2531位点不同基因型的分布频率差异无统计意义(P=0.653);吸烟、饮酒、辛辣食物、腌熏食物、饮水情况、摄入新鲜蔬菜水果等环境因素均未显示与hMLH3基因2531位点基因多态性有相关性。结论 hMLH3基因2531位点多态性与新疆哈萨克族食管癌家族的聚集性相关,未发现hMLH3基因2531位点多态性与新疆哈萨克族食管癌的发病及环境因素有关。

MLH3基因C2531T多态性与云南地区女性不孕的相关性研究

目的:研究MLH3基因的C2531T位点多态性和云南地区女性不孕的相关性。方法:收集云南地区140例不孕症女性患者(不孕组)和403例正常育龄期已生育妇女(正常对照组)的血液样本。通过PCR扩增测序方法检测MLH3基因的C2531T多态性。结果:正常对照组MLH3基因的C2531T多态性位点等位基因C和T的频率分别为83.9%和16.1%,不孕组分别为85.0%和15.0%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。CC、CT和TT基因型在不孕组和正常对照组中分别为70.7%vs 73.2%、26.4%vs 23.6%和2.9%vs 3.2%,两组各基因型频率比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:MLH3基因C2531T多态性位点与云南地区女性人群不孕风险不具有相关性。

错配修复蛋白Mlh3对四膜虫有性生殖是必需的

DNA错配修复(mismatch repair,MMR)是一种进化中保守的机制,它校正DNA复制过程中产生的错误,维持基因组的稳定性。MMR家族蛋白同时也参与多种DNA相关的生物学功能。本研究从嗜热四膜虫鉴定了一种新的错配修复蛋白MLH3基因,该基因预测编码319个氨基酸,在有性生殖期特异表达。免疫荧光定位表明,HA-Mlh3定位在有性生殖期减数分裂的小核和新发育的大核中。MLH3敲除的突变体细胞株,在有性生殖发育期停滞在两大核和两小核阶段,新大核DNA复制受阻。γ-H2A.X检测表明,新大核和小核有性生殖后期断裂的基因组不能正常修复,发育中的细胞裂解,不能形成有性生殖后代。结果表明,Mlh3参与四膜虫新大核发育过程基因组的断裂修复和复制,对四膜虫的有性生殖是必需的。

金属离子促进嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性

嗜热四膜虫有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究人工合成MLH3(TTHERM_001044369)基因,构建重组表达质粒p GEXMLH3,转化大肠杆菌BL21(DE3)并获得重组表达的GST-Mlh3蛋白。纯化的GST-Mlh3蛋白在配位不同的金属离子Cu^(2+)、Mn^(2+)、Mg^(2+)后,有效切割超螺旋质粒DNA。ATP和ADP可进一步促进Mlh3的核酸内切酶活性。突变Mlh3中离子结合模体DQHA(X)2E(E)4E中的D117和E123位点,Mlh3D117N/E123A的核酸内切酶活性降低。进一步删除离子结合和ATP结合位点的C端结构域,突变体的核酸内切酶活性进一步降低,表明Mlh3的核酸内切酶活性是离子依赖型。减数分裂期HA-Mlh3免疫共沉淀鉴定了Mlh3可能的相互作用因子链交换蛋白Dmc1、DSB修复蛋白Mnd1、Mut S、染色体维持蛋白Smc2和Smc4。结果表明,四膜虫的Mlh3通过金属离子依赖的内切酶活性,以及与其他因子相互作用,在减数分裂错配修复和同源重组过程中发挥重要作用。

MLH3和MSH2遗传变异与直肠癌患者术前同步放化疗敏感性和生存的关系

目的探讨DNA错配修复基因MLH1、MLH3和MSH2遗传变异与局部进展期直肠癌患者术前同步放化疗敏感性及预后的关系。方法采用Sequenom MassARRAY平台检测146例接受术前同步放化疗直肠癌患者MLH1、MLH3和MSH2基因14个标签SNP位点（htSNP）的基因型，并分析其与患者术前同步放化疗敏感性和总生存时间的关系。采用非条件Logistic回归模型和Cox比例风险回归模型计算影响局部进展期直肠癌患者术前同步放化疗敏感性和预后的独立影响因素。结果146例患者均接受卡培他滨和奥沙利铂双药的术前同步放化疗，其中敏感组64例，抵抗组82例。关联分析结果显示，MLH3基因的rs175057 C〉T和MSH2基因的rs13019654 G〉T变异与术前同步放化疗敏感性明显相关。与携带rs175057 CC基因型患者比较，携带CT和TT基因型患者对同步放化疗的敏感性增加，治疗抵抗风险降低（OR＝0.42，95% CI为0.19～0.91，P＝0.029）。与携带rs13019654 GG基因型患者比较，携带GT和TT基因型患者对同步放化疗的敏感性增加，治疗抵抗风险降低（OR＝0.49，95%CI为0.24～0.98，P＝0.047）。rs1540354、rs4026175、rs1981929、rs2042649、rs2303428、rs3771273、rs4608577、rs4952887、rs6544991、rs6544997、rs10188090和rs10191478与术前同步放化疗的敏感性未见明显相关。多因素生存分析结果显示，MLH3基因的rs175057 C〉T变异延长直肠癌患者的总生存时间，降低患者死亡风险（HR＝0.44，95%CI为0.20～0.96，P＝0.038）；MSH2基因的rs3771273 T〉A、rs10188090 A〉G、rs10191478 T〉G变异缩短直肠癌患者的总生存时间，增高患者死亡风险（HR＝1.74，95%CI为1.06～2.84，P＝0.028；HR＝1.64，95%CI为1.01～2.66，P＝0.046；HR＝1.71，95%CI为1.01～2.91，P＝0.047）。rs1540354、rs4026175、rs1981929、rs2042649、rs2303428、rs4608577、rs4952887、rs6544991、rs6544997和rs13019654与患者的总生存时间未见明显相关。结论MLH3基因的rs175057和MSH2基因的rs13019654为影响局部进展期直肠癌患者术前同步放化疗敏感性的独立因素，MLH3基因的rs175057和MSH2基因的rs3771273、rs10188090、rs10191478可能是预测局部进展期直肠癌患者术前同步放化疗预后的遗传标志，对于直肠癌患者的个性化治疗具有潜在价值。

老年高血压患者肝肾阴虚证的特征

目的观察老年高血压患者肝肾阴虚证临床特征及外周血标识基因表达,为中医辨证论治老年高血压提供依据。方法本研究首先分析老年高血压患者高血压分级和病程与肝肾阴虚证的相关性;再根据全基因组芯片在原发性肝癌患者的肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证组中筛选的具有差异表达的17个基因mRNA的表达,基于异病同证原理,应用实时荧光定量PCR技术探索性观察老年高血压肝肾阴虚证患者的外周血单个核细胞中是否存在同样的17个差异基因mRNA的表达。并应用受试者特征性操作曲线(ROC曲线)构建肝肾阴虚证的诊断模型。结果研究共纳入老年高血压患者(>65岁)60名,其中肝肾阴虚证患者30名,非肝肾阴虚证患者30名,随着高血压病程延长,老年高血压肝肾阴虚证患者更多;与非肝肾阴虚证患者相比,老年高血压肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞中MLH3表达减少,CD55表达增加,差异具有统计学意义,进一步采用ROC分析,AUCMLH3=0.783,AUCCD55=0.737,MLH3和CD55作为老年高血压肝肾阴虚证诊断模型的灵敏度分别为63.5%、57%,特异度分别为93%,90%。结论 MLH3和CD55可能是老年高血压肝肾阴虚证的标识基因。