AKT-Foxo3a信号通路调控小鼠MMP-20基因表达的研究

目的:本研究旨在探讨AKT-Foxo3a信号通路在基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达中的作用。方法:分别通过免疫组化技术、实时定量RT-PCR技术以及双荧光素酶报告基因检测系统分析AKT-Foxo3a信号通路对MMP-20启动子转录活性的影响。结果:免疫组化染色结果显示,AKT及磷酸化Foxo3a(P-Foxo3a)均在分泌期成釉细胞核中呈阳性表达;RT-PCR检测结果显示,AKT阻断剂可显著抑制Foxo3a诱导的MMP-20基因的表达(P﹤0.05);双荧光素酶分析结果显示,AKT阻断剂亦可显著抑制Foxo3a调控MMP-20基因启动子的转录活性(P﹤0.05)。结论:转录因子Foxo3a可能通过AKT-Foxo3a信号通路调控MMP-20基因的表达,从而参与釉质发育过程。

氟对大鼠切牙成釉细胞MMP-20及TIMP-2表达的影响及褪黑素对氟的拮抗作用

目的:通过研究不同浓度氟对大鼠切牙成釉细胞基质金属蛋白酶(MMP-20)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2)表达的影响,探讨氟斑牙的发病机制,并通过比较给氟组与加褪黑素组MMP-20、TIMP-2表达的差异,探讨褪黑素是否对氟斑牙的发生有拮抗作用。方法:40只Wistar大鼠随机分为6组,分别为对照组(A)、低氟组(B)、高氟组(C)、低氟组加褪黑素组(D)、高氟组加褪黑素组(E)和对照组加生理盐水组(F),建立氟斑牙动物模型。用HE染色和免疫组化染色观察不同浓度的氟及褪黑素对大鼠切牙成釉细胞的形态及MMP-20、TIMP-2表达的影响,采用MetaMorph显微图像分析系统和SPSS12.0软件包,分别进行图像和数据统计学分析。结果:给氟组大鼠切牙牙面出现白垩色改变,可见釉质表面横纹;成釉细胞形态发生改变,细胞排列紊乱,甚至成灶性堆积,可见空泡性变;MMP-20、TIMP-2在分泌期成釉细胞、成牙本质细胞均有表达,MMP-20在低氟组、高氟组的表达均显著低于对照组(P﹤0.01),但低氟组和高氟组之间无显著差别;TIMP-2在对照组和高氟组的表达差异有显著性(P﹤0.01),对照组和低氟组、低氟组和高氟组表达均无显著差别(P﹥0.05)。褪黑素组与未加褪黑素组两者的表达无显著差别。结论:过量氟可抑制MMP-20的表达,使MMP-20/TIMP-2的表达失衡,成釉基质蛋白清除延迟,导致釉质矿化不良,形成氟斑牙,褪黑素对氟斑牙的形成无拮抗作用。

氟对大鼠成釉细胞中MMP-20、KLK4表达的影响

目的观察用含不同浓度氟饮水喂养的SD大鼠所产的子鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(MMP-20)、激肽释放酶(KLK4)的表达变化,探讨氟牙症的发病机制。方法给母体SD大鼠分别饮用氟质量浓度为0、50、100mg/L的饮水,待母鼠自然分娩后,取其子鼠下颌骨制作切片并提取牙胚组织,分别用免疫组化和实时定量PCR方法检测不同染氟组大鼠成釉细胞中MMP-20及KLK4的蛋白及基因表达,应用Image-Pro Plus 6.0和GraphPad Prism 5软件对免疫组化和PCR数据结果进行分析。结果①随着饮水氟质量浓度的增加,成釉细胞中MMP-20蛋白及其mRNA的表达量逐渐减少;②KLK4蛋白和KLK4mRNA的表达量在两实验组呈现了类似的变化,但高氟组与低氟组间的差别不明显。结论氟可使成釉细胞减少对MMP-20及KLK4的分泌。这可能是釉基质蛋白降解延迟、釉质矿化异常,最终导致氟牙症产生的机制之一。

转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究

目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。

MEF2C调控成釉细胞MMP-20基因启动子转录活性的研究

目的:通过研究MEF2C转录因子对小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloprotei-nase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,明确MEF2C的功能,为研究MEF2C在釉质形成中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR的方法扩增小鼠MEF2C基因,并构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-MEF2C;对MMP-20基因启动子区域(-1197～+23)中MEF2C潜在的结合位点进行定点突变,并构建至荧光报告载体pGL3-Basic中;利用双荧光素酶基因报告系统分析MEF2C对MMP-20基因启动子转录活性的影响。结果:在成釉细胞中过量表达MEF2C能够明显提高MMP-20基因启动子的转录活性,而对定点突变后的MMP-20基因启动子转录调控作用减弱。结论:小鼠成釉细胞核中MEF2C可通过MMP-20启动子上MEF2C潜在的结合位点,上调MMP-20基因表达水平。

转录因子Ets-1表达载体的构建及调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达

目的构建转录因子Ets-1的pcDNA331／myc-HisA真核表达载体，转染小鼠成釉细胞，检测Ets-1调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达，为研究Ets-1在牙釉质发育过程中的重要作用奠定基础。方法以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得eDNA为模板，用RT-PcR法扩增得出含有kpnI和BamHI的Ets-1目的基因连接到pcDNA3．1／myc-HisA真核表达载体上。将重组质粒瞬时转染到小鼠成釉细胞中观察，并通过实时定量RT-PCR的方法检测MMP-20mRNA的相对表达量。结果①经过PCR引物扩增得到-约1399bp的基因片段，重组质粒pcDNA3．1／myc．HisA-Ets-l双酶切进行初步鉴定后，与GenBank登录基因对比显示生物公司测序结果完全正确。（爹重组质粒pcDNA3．1／myc-HisA-Ets-1转染小鼠成釉细胞后（以转染空载体pcDNA3．1／myc-HisA作为对照），实时定量RT-PCR检测MMP-20tuRNA的相对表达量上升明显。结论成功构建了Ets-1的真核表达载体，初步研究证明小鼠成釉细胞核中Ets-1可以上调MMP-20基因表达水平。

SPDEF调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的分子机制研究

目的通过克隆转录因子SPDEF以及其真核表达载体的构建,分析该基因对成釉细胞MMP-20基因表达的影响,为进一步研究转录因子SPDEF在牙釉质形成中发挥的作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术从小鼠成釉细胞中获得SPDEF基因,测序正确后克隆至pcDNA3.1/myc-HisA载体中,将重组质粒瞬时转染成釉细胞,并用双荧光素酶报告基因系统检测技术来检测MMP-20启动子区域的转录活性。结果①SPDEF基因经过RT-PCR扩增得到的产物与预期片段978bp相符,将所获得的目的基因与GenBank提供的已知序列(NM:013891.4)完全一致。②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-SPDEF转染成釉细胞后,用荧光素酶分析系统检测显示MMP-20启动子转录活性升高。结论成功构建了SPDEF真核表达载体,初步研究证明SPDEF可能与MMP-20特征性序列结合从而上调MMP-20的表达。

CCL20和MMP-9在COPD大鼠中的表达及多西环素对其表达的影响

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型中巨噬细胞炎症蛋白-3α(CCL20)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平及多西环素对表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠24只随机分为3组:健康对照组、COPD模型组、多西环素干预组。40天造模完成后,HE染色观察各组大鼠肺组织的病理改变,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中CCL20、MMP-9的含量,免疫组化法观察肺组织内CCL20、MMP-9的蛋白表达情况。结果模型组及干预组气管、支气管及肺组织中出现慢性气管炎、阻塞性肺气肿的特征性病理改变,符合人类COPD的特点。光镜下模型组肺泡管、肺泡囊和肺泡明显扩张,肺泡壁变薄并有不同程度的断裂;干预组大鼠肺泡壁断裂和肺泡腔扩张情况较模型组明显减轻。与对照组比较,模型组、干预组肺泡灌洗液(BALF)中CCL20、MMP-9的含量显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,干预组BALF中CCL20含量差异无统计学意义(P>0.05);MMP-9的含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组、干预组肺组织中CCL20、MMP-9蛋白表达明显增强(P<0.05)。与模型组比较,干预组肺组织中CCL20蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);MMP-9蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论 CCL20可能通过免疫反应参与COPD持续的慢性炎症过程;多西环素可能通过调节MMP-9的表达,减轻肺气肿时肺泡壁的破坏,发挥阻止COPD进展的作用。

针刺对脑出血大鼠神经功能恢复及MMP-9表达的研究

目的:通过针刺百会透悬厘治疗研究脑出血大鼠神经功能恢复的机制与机理。方法:将96只雄性Wistar大鼠随机分三组(对照组,模型组,针刺组),每组32只,再分到四个时间点,即每点8只。造模成功后6h进行针刺治疗,然后在对应点(12h、24h、3天、7天)停止治疗,测定神经功能情况,取材并检测MMP-9表达。结果:针刺治疗明显降低大鼠神经功能缺损程度;并对MMP-9表达有抑制作用,进而促进脑出血的恢复。针刺组与其他两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:百会透刺悬厘治疗能明显降低神经功能缺损程度,修复脑出血受损的神经元细胞,减轻脑水肿。

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。

釉基质蛋白酶与氟牙症的发病机制

目前认为,釉原蛋白降解延迟和清除障碍是氟牙症形成的关键。一些研究表明,氟可减少在釉原蛋白被水解、清除过程中发挥重要作用的釉基质蛋白酶的表达。釉基质蛋白溶解酶包括基质金属蛋白酶(MMP-20)和丝氨酸蛋白酶(KLK4)。本文从分子结构和生物学功能等方面对两种酶的研究现状进行了系统回顾,同时分析了氟对釉基质蛋白酶的可能影响及其与氟牙症发病机制间的关系。