枸杞多糖通过激活Nrf2/HO-1通路保护HK-2细胞氧化损伤的作用

目的分析枸杞多糖(LBP)干预对氧化损伤的人肾小管上皮细胞(HK-2)内的核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)通路蛋白表达的变化,探索LBP拮抗HK-2细胞氧化损伤的分子机制。方法采用过氧化氢诱导HK-2细胞制备氧化损伤细胞模型,HK-2被分成4组:正常组、LBP组、氧化损伤组及LBP干预组。观察4组细胞的长势和形态变化;细胞活力测定法比较每组细胞的存活率;比色法分析氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的水平;免疫印迹技术检测细胞内Nrf2/HO-1通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平。结果正常组和LBP组相比,两组的细胞长势、形态和存活率,细胞产生MDA的量、SOD和GSH-Px的水平,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平均无明显差异(均P>0.05);氧化损伤组和正常组相比,细胞皱缩变圆并脱落、贴壁细胞变少,存活率减少、MDA量增加、SOD和GSH-Px降低,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值下降(均P<0.05);LBP干预组和氧化损伤组相比,细胞长势、形状恢复、贴壁细胞较多,存活率增加、MDA量减少、SOD和GSH-Px升高,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值升高(均P<0.05)。结论枸杞多糖能通过激活Nrf2/HO-1通路提高HK-2细胞的抗氧化酶活性达到减轻细胞氧化损伤的目的。

梓醇调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路对口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探究梓醇调节Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1/核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Keap1/Nrf2/HO-1)信号通路对口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的影响。方法体外培养口腔鳞癌细胞Tac8113;CCK-8法筛选梓醇最佳作用水平;将Tac8113细胞分为对照组、梓醇组(24μg/mL)、sh-NC组(转染sh-NC慢病毒质粒)、sh-Keap1组(转染sh-Keap1慢病毒质粒)、梓醇+sh-NC组(转染sh-NC+24μg/mL梓醇)、梓醇+sh-Keap1组(转染sh-Keap1+24μg/mL梓醇);CCK-8法检测细胞增殖;划痕试验检测细胞迁移;流式细胞术检测细胞凋亡;2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平;采用试剂盒分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;Western Blot分别检测Keap1/Nrf2/HO-1信号通路及凋亡相关蛋白表达水平。结果与0μg/mL组比较,随着梓醇剂量增加Tac8113细胞存活率显著降低(P<0.05),因此,选择24μg/mL梓醇作为后续实验的干预条件;与对照组比较,梓醇组Tac8113细胞OD450值、划痕愈合率、ROS水平、MDA水平及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Nrf2、HO-1表达显著降低,细胞凋亡率、SOD水平及Keap1、胱天蛋白酶3(caspase3)表达显著升高(P<0.05);Keap1低表达后Tac8113细胞恶性生物学行为程度加重,且逆转了梓醇对Tac8113细胞恶性生物学行为的影响。结论梓醇抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡发挥抑癌作用,可能与上调Keap1表达,下调Nrf2和HO-1表达有关。

香叶醇通过调控Nrf2/HO-1途径调节氧化应激减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的研究香叶醇对脑缺血/再灌注(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)后Nrf2/HO-1信号通路的调控作用。方法随机将雄性SD大鼠分成假手术组(sham)、假手术+200 mg·kg^(-1)香叶醇组、缺血/再灌注(I/R)组、I/R+50 mg·kg^(-1)香叶醇组、I/R+100 mg·kg^(-1)香叶醇组、I/R+200 mg·kg^(-1)香叶醇组、依达拉奉组,I/R+brusatol(Nrf2抑制剂)组、I/R+200 mg·kg^(-1)香叶醇+brusatol组。大鼠在MCAO术前5 d连续腹腔注射香叶醇,术后再次腹腔注射香叶醇。假手术组和假手术+200 mg·kg^(-1)香叶醇组只分离血管不插栓线,其余组别使用线栓法建立大鼠CIRI损伤模型。通过改良神经功能评分表评定大鼠神经功能受损情况;TTC脑片染色测定大鼠脑梗死体积;HE染色观察大鼠缺血侧皮层受损情况;TUNEL凋亡染色测定大鼠皮层细胞凋亡情况;测定氧化应激相关参数;免疫组织化学染色法检测Nrf2和HO-1蛋白的表达;Western blot检测受损侧皮层组织中目的蛋白表达水平。结果与模型组相比,香叶醇给药组能明显改善大鼠神经损伤症状、减少脑梗死体积和改善大鼠脑受损皮层的损伤情况;同时减少细胞凋亡的发生;并且香叶醇干预组能明显增加大鼠右侧皮质Nrf2/HO-1蛋白的表达,降低氧化应激水平。结论香叶醇通过激活Nrf2/HO-1信号途径,改善缺血/再灌注所致的大鼠缺血性脑损伤。

基于Nrf2-HO-1/GPX4信号轴探讨中药靛玉红衍生物E804抑制肺癌A549细胞增殖和迁移的作用机制

目的 探讨中药靛玉红衍生物E804对非小细胞肺癌(NSCLC)系A549细胞增殖和迁移的影响,并阐明Nrf2-HO-1/GPX4信号轴可能的作用机制。方法 以肺癌A549细胞为细胞模型。采用MTT和细胞划痕实验观察0、10μmol/L E804和10μmol/L E804+不同特异性抑制剂(Nec-1、CQ、Z-VAD、DFO、Fer-1和Lip-1)组细胞的增殖和迁移能力;采用DCFH-DA荧光探针法检测0、2.5、5和10μmol/LE804组细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测二价铁离子(Fe^(2+))含量,分光光度法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量,微量法检测丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测0、2.5、5和10μmol/L E804组细胞SLC7A11、Transferrin、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果 与对照组(0μmol/LE804)比较,2.5、5和10μmol/L E804升高细胞内ROS、Fe^(2+)和MDA水平,降低细胞内GSH含量(P<0.01),同时降低SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.01),升高Transferrin表达水平(P<0.05)。与单独使用10μmol/LE804组比较,细胞凋亡抑制剂(Z-VAD)组和细胞铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1和Lip-1)组能够部分逆转E804对A549细胞的增殖和迁移抑制(P<0.01)。结论 E804可抑制A549细胞增殖和迁移,并诱发铁死亡,其机制可能与抑制Nrf2-HO-1/GPX4信号轴有关。

氧化苦参碱水凝胶通过激活角化细胞Nrf2/HO-1通路促进创面愈合

背景:慢性创面炎症和氧化应激阻碍了角化细胞的再生,氧化苦参碱具有抗氧化、抗炎等多种生物活性,可能具有促进创面愈合的潜在效应。目的:探讨氧化苦参碱对创面愈合的作用,以及对H_(2)O_(2)诱导人角质形成细胞系HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用。方法:①体内实验:分别制备含0,0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)水凝胶。在75只糖尿病小鼠背中部制作直径12 mm的全层皮肤缺损模型,随机分5组干预,每组15只:模型组创面包扎固定,单纯水凝胶组以HAMA水凝胶覆盖创面,低、中、高剂量氧化苦参碱组分别以含0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的HAMA水凝胶覆盖创面,光固化后包扎固定,14 d内进行相关指标的检测。②体外实验:将人角质形成细胞系HaCaT分5组培养,正常组常规培养,H_(2)O_(2)组及低、中、高浓度氧化苦参碱组均加入H_(2)O_(2)干预4 h,然后分别更换为含0,0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的培养基,培养24 h后进行相关指标的检测。结果与结论:①体内实验:与模型组比较,单纯水凝胶组小鼠创面愈合率无明显变化,低、中、高剂量氧化苦参碱组治疗后7,14 d的创面愈合率升高(P<0.05)。治疗后14 d的创面样本切片病理观察显示,与模型组相比,中、高剂量氧化苦参碱组再生表皮层厚度、显微血管数量与胶原沉积均增加(P<0.05)。术后7 d的创面样本Western blotting检测显示,与模型组相比,中、高剂量氧化苦参碱组肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的蛋白表达降低(P<0.05)。②体外实验:CCK-8检测、EdU及Ki67染色显示,与H_(2)O_(2)组相比,中、高浓度氧化苦参碱组细胞增殖能力明显升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,中、高浓度氧化苦参碱组线粒体膜电位升高(P<0.05)、活性氧含量降低(P<0.05)。Western blotting检测显示,与H_(2)O_(2)组相比,高浓度氧化苦参碱组Nrf2核蛋白、Nrf2总蛋白、HO-1蛋白及超氧化物歧化酶1蛋白的表达增加(P<0.05)。③结果表明:氧化苦参碱能够通过上调Nrf2、HO-1蛋白减轻HaCat细胞的氧化应激损伤,加速创面愈合。

HO-1对IPEC-J2细胞氧化损伤的缓解作用

旨在研究HO-1对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)氧化损伤的缓解作用。利用不同浓度H_(2)O_(2)(100、200、300、400、500、600、1000μmol/L)分别处理IPEC-J2细胞6、12、24 h,利用CCK-8法检测细胞活力,确定H_(2)O_(2)处理细胞的浓度。将IPEC-J2细胞分为对照组(CT)、H_(2)O_(2)组、HO-1+H_(2)O_(2)组,每组3个重复。RT-qPCR检测IPEC-J2细胞中IL-1α、IL-6、IL-8、Keap1、Nrf2 mRNA的相对表达丰度;ELISA检测IPEC-J2细胞中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)活性;化学荧光法检测细胞中活性氧(ROS)水平。结果显示,随着H_(2)O_(2)浓度的增加,IPEC-J2细胞活力降低,400μmol/L H_(2)O_(2)处理12 h,600μmol/L H_(2)O_(2)处理6 h或24 h,IPEC-J2细胞活力均降至50%以下。根据细胞活力下降50%的原则,后续选用400μmol/L H_(2)O_(2)处理IPEC-J2细胞12 h。与CT组相比,H_(2)O_(2)组IPEC-J2细胞中的IL-1α(P<0.05)、IL-6(P<0.01)和IL-8(P<0.01)mRNA相对表达丰度增加,细胞中ROS荧光强度增强(P<0.01)和MDA含量(P<0.001)升高。与H_(2)O_(2)组相比,HO-1+H_(2)O_(2)组IPEC-J2细胞中IL-6(P<0.05)、IL-1α(P<0.01)和IL-8(P<0.05)mRNA相对表达丰度降低,细胞中ROS荧光强度减弱(P<0.05)和MDA含量显著下降(P<0.01)。Keap1/Nrf2信号结果显示,H_(2)O_(2)上调Keap1 mRNA表达(P<0.01),下调Nrf2 mRNA表达(P<0.01),降低CAT活性(P<0.01);HO-1与H_(2)O_(2)共处理,IPEC-J2细胞中Keap1 mRNA表达下调(P<0.01),Nrf2 mRNA表达上调(P<0.01),CAT活性升高(P<0.01)。提示400μmol/L H_(2)O_(2)能诱导IPEC-J2细胞发生氧化损伤,HO-1能在一定程度上缓解H_(2)O_(2)诱导IPEC-J2细胞的氧化损伤,HO-1能激活H_(2)O_(2)抑制的Keap1/Nrf2信号,促进抗氧化酶CAT的产生,发挥抑炎、抗氧化作用。

基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法,实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料,构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒,利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响,并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示,Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点,并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示,水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示,6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上,本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒,可用于抗水生病毒药物的筛选,也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。

罗格列酮通过诱导HO-1减轻大鼠肝缺血再灌注损伤的作用机制

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ)激动剂罗格列酮是否通过调控血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)活性来减轻大鼠肝缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)。方法建立大鼠70%肝脏热缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型和缺氧缺糖/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)诱导的大鼠肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)损伤模型,随机分为假手术组、模型组、罗格列酮预处理组和锌原卟啉(zinc protoporphyrin,ZnPP)组(n=6)。全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST水平;HE染色评估肝组织病理学损伤;Western blot检测PPAR-γ和HO-1蛋白表达水平;CCK8法测定LSECs的细胞活力,流式细胞仪测定LSECs中活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。结果与I/R组相比,罗格列酮预处理能显著降低肝IRI大鼠ALT、AST水平(P<0.01),减少肝细胞凋亡并减轻肝组织IRI(P<0.01)。Western blot结果显示,罗格列酮能上调PPAR-γ和HO-1蛋白的表达(P<0.01)。此外,罗格列酮预处理(10,30μmol/L)能改善OGD/R诱导的LSECs存活率,显著降低细胞ROS含量,并呈剂量反应相关性(P<0.01)。使用ZnPP阻断HO-1活性后,罗格列酮对大鼠肝IRI的保护作用均消失。结论罗格列酮通过上调HO-1活性介导抗氧化和抗炎作用,减轻大鼠肝IRI。

薯蓣皂苷通过GSK3β/Nrf2/HO-1通路改善尿酸诱导的HK-2细胞氧化应激损伤的作用及机制研究

目的探讨薯蓣皂苷(dioscin)对尿酸(uric acid,UA)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)氧化应激损伤的影响及分子机制。方法将HK-2细胞分为正常组、模型组(尿酸刺激造模)、条件对照组(尿酸+DMSO)和薯蓣皂苷组(尿酸+薯蓣皂苷)。通过尿酸诱导HK-2细胞氧化应激损伤模型;采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞技术检测细胞活性氧(ROS)水平,Real-time PCR法检测糖原合成激酶3(GSK3β)、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)在mRNA水平的表达,Western Blot法检测GSK3β、磷酸化糖原合成激酶3(p-GSK3β)、Nrf2及HO-1在蛋白水平的表达。结果经尿酸刺激后,HK-2细胞的活力明显下降,ROS水平明显升高(均P<0.001)。经薯蓣皂苷治疗后,HK-2细胞的活力增加,ROS水平明显降低(均P<0.001)。在蛋白及mRNA水平上,尿酸刺激后Nrf2和HO-1的表达均下降,薯蓣皂苷干预后Nrf2和HO-1表达均明显增加(均P<0.001)。在蛋白水平上,模型组细胞p-GSK3β/GSK3β比值较正常组明显下降,经薯蓣皂苷干预后p-GSK3β/GSK3β比值升高(均P<0.001)。结论薯蓣皂苷可能是通过促进GSK3β的磷酸化,激活Nrf2/HO-1通路,从而缓解尿酸诱导的HK-2细胞氧化应激损伤。

黄芪甲苷调控Nrf2/HO-1信号通路对血管内皮细胞氧化损伤的影响

目的 基于细胞实验研究黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AST-Ⅳ)调控核转录因子红系2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)信号通路对血管内皮氧化损伤的影响。方法 采用1-棕榈酰基-2-(5'-氧-戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱[1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine,POVPC]刺激血管内皮细胞24 h建立血管内皮细胞氧化损伤模型,随机分为模型(Model)组(35μmol/L POVPC)、AST-Ⅳ低剂量(AST-L)组(35μmol/L POVPC+50μmol/L AST-Ⅳ)、AST-Ⅳ高剂量(AST-H)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ)及AST-Ⅳ高剂量+ML385(Nrf2抑制剂)(AST-H+ML385)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ+5μmol/L ML385),以正常未处理细胞作为对照(Control)组。免疫荧光鉴定大鼠胸主动脉内皮细胞(aortic vascular endothelium cell,AVEC),CCK-8检测AST-Ⅳ细胞增殖情况,Transwell小室检测AVEC迁移情况,Matrigel基质胶检测细胞血管形成功能,鬼笔环肽染色检测细胞骨架结构,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,RT-qPCR和Western blot检测Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达情况。结果 免疫荧光鉴定所提取的细胞,可特异性表达血管性血友病因子(von willebrand factor,v WF),鉴定为AVEC。与Control组相比,Model组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏明显,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的m RNA及蛋白表达水平下调(P<0.01或P<0.05)。与Model组比较,AST-L组及AST-H组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著升高(P<0.01),细胞骨架破坏得到较好修复,细胞内ROS水平显著下降(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著增加(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.01),且以AST-H组效果更为显著(P<0.01)。与AST-H组比较,ASTH+ML385组迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏增加,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论 AST对血管内皮氧化损伤具有保护作用,且有一定的剂量依赖性,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。

NE激活Nrf2/HO-1信号通路调节人子宫内膜上皮细胞的氧化应激

目的明确去甲肾上腺素(NE)是否能通过核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)调控培养的人子宫内膜上皮细胞(hEECs)的氧化应激状态。方法培养hEECs,通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测α和β肾上腺素能受体在hEECs的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验确定NE处理对细胞活性的影响,根据结果将细胞分为处理组和对照组,选择合适浓度进行处理;通过Western blot实验,检测闭锁蛋白(Occludin),闭锁小带蛋白-1(ZO-1),凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),抗氧化应激蛋白Nrf2、HO-1的表达,流式细胞术检测NE处理后细胞凋亡的情况;酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平。结果在hEECs上检测到α1 a、α1 b、α2 a、α2 b、α2 c、β1、β3肾上腺素能受体的表达。NE处理后,在低浓度(5、10μmol/L)不明显影响细胞活力,而15、20μmol/L NE处理细胞6 h或24 h均明显增加细胞活性。紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在15μmol/L 24 h处理组显著升高。ZO-1在6 h处理组下降,15μmol/L处理显著下降,同时Occludin在6 h处理组升高。NE处理后与对照相比,细胞凋亡率升高,15μmol/L NE处理细胞6 h凋亡率显著升高,处理24 h后细胞凋亡率有所下降,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax>1。NE处理后,上调Nrf2及HO-1,细胞培养基上清液中的MDA水平没有明显升高,同时SOD水平明显上调。结论NE处理细胞后可通过激活Nrf2/HO-1信号,上调SOD,发挥抗氧化应激、抗凋亡的作用。

右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制肾小管上皮细胞的铁死亡

目的 探讨右美托咪定(DEX)对Erastin诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)铁死亡的保护作用及其机制。方法 构建Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+2.5μmol/L DEX组、Erastin+5μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX组,采用CCK-8法检测细胞的存活率。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+10μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX+ML385(Nrf2抑制剂)组。采用CCK-8法检测细胞的存活率;使用细胞亚铁比色法测试盒检测细胞内Fe^(2+)水平的变化;应用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的含量;使用丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测细胞中MDA及GSH含量;Western blotting检测细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达。结果 与对照组相比,Erastin组的细胞存活率显著被抑制(P<0.001),同时细胞中GSH含量降低(P<0.001),Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.001);与Erastin组相比,Erastin+10μmol/L DEX组的细胞存活率明显升高(P<0.001),10μmol/L DEX显著升高细胞中GSH含量(P<0.001),显著降低Fe^(2+)、ROS以及MDA含量(P<0.001),并且显著上调细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达(P<0.001)。使用ML385后,Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制(P<0.001),细胞存活率降低(P<0.001),GSH含量降低(P<0.001),而Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.05)。结论 DEX对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。

汉黄芩素通过NRF2/HO-1信号途径诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡

目的:探讨汉黄芩素(WOG)通过核因子E2相关因子2(NRF2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号途径诱导胶原诱导性关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(大鼠CIA-FLS细胞)铁死亡的机制。方法:将大鼠CIA-FLS细胞分为:对照组、低、中、高剂量(25、50和100μmol/L)汉黄芩素组、铁死亡抑制剂(LIP-1)组、LIP-1+高剂量汉黄芩素组、HO-1激动剂钴原卟啉(COPP)组和COPP+高剂量汉黄芩素组,CCK-8法检测细胞活力;结晶紫染色法检测细胞形态;检测氧化应激标志物谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的含量,Western blot检测Kelch样ECH关联蛋白1(KEAP-1)、NRF2和HO-1蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,给予WOG处理后,大鼠CIA-FLS细胞活力显著下降(P<0.01),氧化应激水平显著上升(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),NRF2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),KEAP-1水平显著增加(P<0.01);与WOG组相比,LIP-1处理组的细胞活力显著上升(P<0.01),氧化应激水平显著下降(P<0.01),ROS含量显著减少(P<0.01);与WOG组相比,加入COPP后,NRF2和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01),KEAP-1水平显著下降(P<0.01)。结论:WOG能通过NRF2/HO-1信号途径,促进氧化应激来诱导大鼠CIA-FLS细胞铁死亡。

人成骨细胞株HOS TE85致瘤性转化的研究

目的建立人成骨细胞株HOS TE85致瘤性转化的模型,作为骨肉瘤癌变过程细胞分子生物学研究的模型。方法通过克隆形成率实验确定N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-m ethyl-N-′n itro-N-n itrosoguan id ine,MNNG)对HOS TE85细胞转化浓度后,以MNNG作启动剂,佛波酯(12-0-Te-tradecanoyl phorbol 13-acetate,TPA)作促进剂对其进行转化,66 d后通过细胞形态、软琼脂集落形成实验和裸鼠体内致瘤实验鉴定细胞转化程度。结果经MNNG和TPA协同处理HOS TE85细胞66 d后,细胞中出现形态异常的转化灶,转化灶细胞失去接触抑制;转化细胞凝集性增强;软琼脂克隆形成率明显增加;转化细胞在裸鼠皮下成瘤,病理组织学证实为低分化骨肉瘤。结论模拟人体细胞发生恶性转化的过程,建立了HOSTE85的恶性转化模型。

TRAIL诱导骨肉瘤HOS-8603细胞凋亡与线粒体跨膜电位关系的研究

目的研究TRAIL诱导HOS-8603细胞凋亡与线粒体跨膜电位(ΔΨm)关系。方法MTT法测定TRAIL对HOS-8603细胞的抑制率;将HOS-8603细胞分别用TRAIL、TRAIL+1.0μg/ml环孢菌素A(CsA)处理,然后用透射电镜观察HOS-8603细胞形态学变化;用流式细胞术分别测定亚G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的ΔΨm。结果MTT还原试验表明:作用24小时后,2.5μg/mlTRAIL的抑制率为29%;5μg/mlTRAIL的抑制率为83%。HOS-8603细胞经TRAIL作用后,透射电镜下观察到典型的凋亡形态特征;随着TRAIL作用时间增加,HOS-8603细胞凋亡数增加和ΔΨm降低(F=33.831P<0.01),两者呈直线相关。CsA不仅能抑制TRAIL诱导HOS-8603细胞ΔΨm降低,而且能减少凋亡细胞数的增加(t=7.103,P<0.01)。结论TRAIL诱导HOS-8603细胞凋亡的线粒体依赖途径是通过使线粒体膜通透性转运孔开放,ΔΨm降低来实现;CsA能部分抑制这些效应。

顺铂诱导骨肉瘤HOS-8603细胞凋亡并降低其线粒体跨膜电位

目的研究顺铂诱导HOS-8603细胞凋亡与线粒体跨膜电位(ΔΨm)关系。方法MTT法测定顺铂对HOS-8603细胞的抑制率;将HOS-8603细胞分别用顺铂、顺铂+1.0ug/ml环孢菌素A(CsA)处理,用透射电镜观察HOS-8603细胞形态学变化;用流式细胞术分别测定亚G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的ΔΨm。结果MTT还原试验表明,作用24小时后,1ug/ml和50ug/ml顺铂的抑制率分别为58.56%,90.69%;HOS-8603细胞经顺铂作用后,透射电镜下观察到典型的凋亡形态特征;随着顺铂作用时间增加,HOS-8603细胞凋亡数增加和ΔΨm降低(P<0.01),两者呈直线相关,CsA能部分抑制这些效应。结论顺铂诱导HOS-8603细胞凋亡的另一途径是通过使线粒体膜通透性转运孔开放,ΔΨm降低来实现的。

钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)_(2)(NMIP)](ClO_(4))_(2)抗骨肉瘤HOS细胞的凋亡

目的探讨钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)2(NMIP)](ClO4)2对人骨肉瘤HOS细胞的凋亡作用初步作用机制。方法采用荧光定量PCR检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后RNA变化,蛋白免疫电泳法检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后细胞凋亡蛋白变化。结果钌配合物作用于HOS细胞24 h后,提取总基因逆转录后做荧光定量PCR。相比对照组,25、50、100μmol/L钌配合物组Bcl2的mRNA表达明显降低(分别为0.86±0.02、0.52±0.01、0.4±0.01)(P<0.05),而Bax的mRNA表达明显升高(分别为1.18±0.18、1.7±0.10、1.69±0.10),Caspase3的mRNA表达明显升高(分别为1.22±0.11、1.61±0.12、1.62±0.06)。0、25、50、100μmol/L钌配合物能降低细胞体内Bcl2蛋白表达(分别为0.52±0.03、0.55±0.08、0.39±0.02、0.14±0.01),增加Bax蛋白表达(分别为0.52±0.01、0.60±0.02、0.64±0.03、0.62±0.02),增加Caspase3蛋白表达(分别为0.57±0.01、0.61±0.01、0.68±0.01、0.64±0.01)(P<0.05)。结论钌配合物通过线粒体引起的内源性凋亡通路引起骨肉瘤细胞凋亡。

吴茱萸碱抑制人骨肉瘤HOS细胞的增殖并促进其凋亡

目的探讨吴茱萸碱对骨肉瘤HOS细胞株增殖凋亡的影响及其可能的机制。方法通过利用0、1、2、4、8μmol/L浓度吴茱萸碱处理HOS细胞24、48 h后,利用CCK-8法检测HOS细胞活性。用3μmol/L的吴茱萸碱处理HOS细0、24、48 h后,利用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒染色观察HOS细胞细胞核染色质的形态。用3μmol/L吴茱萸碱处理0、24、48 h后,利用流式细胞仪检测HOS细胞的凋亡率。3μmol/L吴茱萸碱处理0、24、48 h后,Westernblot检测HOS细胞内Caspase 3、Bcl-2蛋白的表达变化情况。结果 2~8μmol/L的吴茱萸碱可抑制HOS细胞的细胞活性,抑制其增殖,呈剂量-时间依赖性。8μmol/L处理48 h后细胞存活率为0.453±0.071,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Hoechst-33258染色观察可见凋亡细胞染色质颜色发白,呈固缩状或者碎裂状染色质,染色质着色不均匀,核形态各异。流式细胞仪检测3μmol/L吴茱萸碱处理HOS细胞0、24、48 h后的凋亡率分别为(5.32±1.62)%、(10.85±1.49)%和(12.47±0.59)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。吴茱萸碱可上调HOS细胞内的Caspase 3蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论吴茱萸碱可降低人骨肉瘤HOS细胞的细胞活性,抑制其体外增殖,诱导其发生凋亡,其机制可能与其上调Caspase 3蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达有关。

GLS1通过激活Nrf2/HO-1轴抑制过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡

目的探究GLS1对过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡的影响及机制。方法ARPE-19细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+Vector组、H_(2)O_(2)+GLS1组,对照组细胞不做任何处理,H_(2)O_(2)组细胞用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48h,H_(2)O_(2)+Vector组和H_(2)O_(2)+GLS1组细胞转染Vector和GLS1质粒后用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48 h,比色法测定各组细胞SOD、GSH和MDA浓度,透射电镜观察各组细胞自噬小体,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62的表达。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组ARPE-19细胞SOD、GSH表达显著下降,MDA显著增加,自噬小体数目显著增加,细胞凋亡显著增加,LC3-Ⅱ表达显著上调,P62、抗核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶1(heme Oxygenase-1,HO-1)表达显著下调。与H_(2)O_(2)+Vector组比较,H_(2)O_(2)+GLS1组细胞SOD、GSH表达显著增加,MDA显著降低,自噬小体数目显著减少,细胞凋亡显著减少,LC3-Ⅱ表达显著下调,P62、Nrf2、HO-1表达显著上调。结论GLS1可抑制H_(2)O_(2)诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡,其机制为激活Nrf2/HO-1信号通路。

阻滞PERK信号通路增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPa-PDT疗法的敏感性

目的观察蛋白激酶样内质网激酶(RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路在焦脱镁叶绿酸-a甲酯介导的光动力疗法(pyropheophorbide-a methyl ester-mediated photodynamic therapy,MPPa-PDT)诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡、自噬中的作用,并探讨阻滞PERK通路增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPa-PDT敏感性的影响及机制。方法 MPPa-PDT处理人骨肉瘤HOS细胞后以Hoechst染色观察胞核形态学变化。以空白组、MPPa组、LED组为对照组,以MPPaPDT处理组(MPPa-PDT)、MPPa-PDT联合PERK通路抑制剂GSK2656157处理组(MPPa-PDT+GSK2656157)、MPPa-PDT联合自噬抑制剂Bafilomycin A1处理组(MPPa-PDT+Bafilomycin A1)为实验组。采用Western blot检测PERK通路相关蛋白PERK、p-PERK、ATF4、CHOP,凋亡相关蛋白Cleavedcaspase3、Cleaved-PARP,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62的表达,免疫荧光检测p-PERK表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 MPPa-PDT诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡、自噬、PERK通路激活,细胞核呈固缩、碎裂等凋亡形态学变化。与空白组、MPPa组、LED组比较,MPPa-PDT组Cleavedcaspase3、Cleaved-PARP、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PERK、ATF4、CHOP表达升高,p-PERK荧光强度增强(P<0.05),而P62、PERK表达降低(P<0.05)。与MPPa-PDT组比较,MPPa-PDT+GSK2656157组p-PERK、ATF4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达降低,p-PERK荧光强度减弱,PERK、P62、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达升高,凋亡增强(P<0.05);与MPPa-PDT组比较,MPPa-PDT+Bafilomycin A1组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达升高,凋亡增强(P<0.05);与MPPa-PDT+GSK2656157组比较,MPPa-PDT+Bafilomycin A1组p-PERK、ATF4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达升高,PERK、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达降低,凋亡减弱(P<0.05)。结论 MPPa-PDT可激活PERK通路,诱导保护性自噬及未折叠蛋白反应,从而促细胞存活。阻滞PERK通路可解除该作用,增强MPPa-PDT对人骨肉瘤HOS细胞的杀伤作用。