牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用

为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,热稳定性好,用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期,检测70份临床奶牛血清,与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71.4%和88.6%的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合,为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法,。

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。

牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定

目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果表达、纯化了45ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。

牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达

为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen-blot分析。结果表明:MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达,其分子质量约为30ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;重组MPB70蛋白可与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组MPB70蛋白能够作为诊断抗原。

牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。

牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析

为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。

牛结核分枝杆菌MPB70+83MAb的制备及胶体金免疫层析试纸条的初步研制

为制备牛结核分枝杆菌(MB)感染早期分泌性蛋白MPB70+83的胶体金标记免疫层析试剂条,本研究将构建的重组大肠杆菌p ET30a(+)-MPB70+83/BL21诱导表达,经纯化后免疫小鼠,制备MPB70+83融合蛋白的单克隆抗体(MAb),对MAb标记胶体金后制备检测试纸,并确定其特异性、灵敏度等技术指标。结果显示,获得分子量为39 ku的MPB70+83融合蛋白,经纯化后重组蛋白的纯度>95%,经4次免疫BALB/c小鼠后,最终获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4H6、5A2、4D11,小鼠腹水MAb效价分别达到1∶12800,1∶12800,1∶25600。制备的腹水MAb均经纯化后浓度分别为2.1 mg/m L、1.8 mg/mL、2.5 mg/mL。对杂交瘤细胞经15代培养,MAb均具有良好的稳定性。利用4D11 MAb标记金颗粒,4H6 MAb包被检测线,并对不同培养物人工污染健康牛血清样品进行检测,结果显示,胶体金试纸对人工污染MB培养物的健康牛血清出现阳性反应,对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌培养物人工污染的健康牛血清的检测均为阴性,最低可以检测到1∶2500倍稀释的MB培养上清。本研究为牛结核分枝杆菌感染的快速检测提供可行技术手段。

牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定

为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。

牛分支杆菌MPB70和CFP10-ESAT6基因的表达与检测

以牛分支杆菌染色体DNA为模板,分别以MPB70、CFP10-ESAT6融合蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入PQE30质粒,构建出原核表达载体PQE30-MPB70,PQE30-CFP10-ESAT6。将质粒转化至感受态DH5α中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外源蛋白带。纯化蛋白后作为包被抗原建立ELISA方法,为进一步研究牛结核病诊断方法奠定基础。

牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测

为了制备牛分枝杆菌的单克隆抗体,本试验利用制备的原核表达的牛分枝杆菌重要抗原蛋白MPB70作为免疫原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术,经过5次亚克隆与筛选,取已免疫好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3500的作用下进行细胞融合。筛选得到了2株分泌抗牛分枝杆菌MPB70蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为Anti-B-MPB70:8和Anti-B-MPB70:12。采用间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行亲和常数检测、效价分析及亚类鉴定,通过SDS-PAGE凝胶试验对单克隆抗体进行纯度分析,并检测其浓度,通过Western blotting方法对单克隆抗体的反应特性进行鉴定。结果显示,纯化后的MPB70蛋白分子质量大小为20 ku,浓度为0.5 mg/mL。两株单克隆抗体的亲和常数分别为9.95×10^9和9.53×10^8;抗体效价分别为1∶102 400和1∶12 800;抗体亚类分别为IgG 2b和IgG 1,轻链类型均为κ型;纯度>90%;浓度分别为3.0和2.2 mg/mL;且具有良好的反应特性。以上研究结果表明,本试验成功制备了抗MPB70蛋白单克隆抗体,可为牛结核病病原和抗体检测技术研究奠定基础。

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-70和pET28a(+),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达载体pET28a-70。将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25 Ku外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。

牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达

为了研究牛结核病新型诊断抗原，试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物，将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b（＋）原核表达载体上，将重组载体转到E．coliBL21（DE3）中，经IPTG诱导获得高效表达，并进行SDS—PAGE和Westen—blot分析。结果表明：MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达，有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达，其分子质量约为30ku，

二类新兽药牛分枝杆菌MPB70／83抗体检测试纸条

2012年09月14日，牛分枝杆菌MPB70／83抗体检测试纸条获得农业部审批，被批准为二类新兽药，【证号：（2012）新兽药证字35号】，该试剂盒是由华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司共同研制，下面对该产品的研发、特点及临床应用作一介绍，为该试剂盒在临床上的应用提供依据。

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆表达

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增其特异性蛋白(MPB70)基因,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建出原核表达载体pGEX-6P-1-MPB70。将质粒转化至感受态BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析可见相应蛋白带。Western blot分析证实,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究牛结核诊断方法奠定基础。

牛型结核分枝杆菌分泌性蛋白MPB70.MPB83基因串联重组质粒的构建及鉴定

目的构建牛型结核分枝杆菌(MB)分泌性蛋白mpb70.mpb83基因串联重组表达质粒,为进--步利用工程菌表达、获得相应抗原蛋白奠定实验基础。方法参考NCBI上公布的MB全基因组序列(EU683972.1),在利用DNAstar7.0生物信息软件分析分泌性蛋白mpb70、mpb83抗原性基础上,选择mpb70、mpb83基因编码多肽主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术构建pGEX-6p-mpb70+mpb83串联重组表达质粒。结果生物信息学预测MPB70、MPB83基因的抗原域分别在30-171位氨基酸和20-190位氨基酸。在mpb70、mpb83间加入16位柔性多肽序列,在线分析不影响mpb70和mpb83融合后的抗原性。pGEX-6p-1-mpb70+mpb83经双酶切获得966bp和4966bp两条片段,与预期一致;测序表明mpb70+mpb83融合基因无碱基突变和缺失,重组质粒构建正确。结论确定了MB早期标识性分泌性蛋白mpb70、mpb83基因的抗原域,获得了mpb70、mpb83串联基因,构建的重组原核表达载体柔性多肽的引人确保mpb70和mpb83的天然抗原构象且不影响融合蛋白的抗原性,为重组抗原的表达,单克隆抗体制备以及建立MB分泌性蛋白标识物的快速检测试剂盒奠定了基础。

间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用

针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。

牛分枝杆菌特异性四联融合蛋白在牛结核病诊断中的临床应用

目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本;以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国黑白花奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清;对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性。结果iELISA与ICG的符合率为93.33%(140/150),与TST的总符合率为87.32%(489/560),与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。结论该方法具有较高的灵敏度与特异性,与其它方法有较高的符合率。

同时检测动物布鲁菌病和结核病胶体金抗体检测试纸条的研制

本研究分别以布鲁菌LPS和牛分枝杆菌MPB70蛋白作为检测抗原,建立了动物布鲁菌病和结核病双抗原夹心法胶体金抗体检测技术,并研制了同时检测动物布鲁菌病和结核病的快速抗体检测试纸条,用于动物布鲁菌病和结核病临床快速血清抗体检测。检测试纸条与其他病原无交叉反应,与牛、鹿口蹄疫血清、巴氏杆菌病血清、耶尔森氏菌病血清无交叉反应;敏感性高,临床采集的布鲁菌病和结核病阳性血清最大稀释倍数可以达到1:512;特异性好,准确率高。研制的检测试纸条与现有的检测方法具有较高符合率:与RBT检测布病结果阳性符合率为100%,阴性符合率为96%,总符合率为96%;与牛结核γ-干扰素ELISA检测结核病结果阳性符合率94%,阴性符合率为97%,总符合率为96%。试纸条检测卡在吉林省多个地区进行临床试验,具有快速、敏感、特异、操作简单、可以用于现场快速检测等优点,能够同时用于动物布鲁菌病和结核病的临床抗体检测。