结核分枝杆菌Ag85A/MPT-64融合基因DNA疫苗的构建及免疫研究中ELISPOT技术的应用

目的构建结核分枝杆菌蛋白Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗,并利用ELISPOT技术检测其免疫原性。方法利用PCR和基因克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85A/MPT-64编码基因,构建真核表达载体,用酶切和双向DNA测序进行鉴定。鉴定正确的阳性克隆重组质粒,肌注免疫小鼠,3周后用ELISPOT法检测抗体滴度。结果 构建到真核载体中的结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A/MPT-64融合基因经序列测定证实无突变。ELISPOT法检测几何平均滴度为1∶1 000。结论以Ag85A/MPT-64融合基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达以及ELISPOT技术的应用,为进一步研究其在结核病与肿瘤防治方面的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的 对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原。

结核分枝杆菌核酸疫苗的构建及其小鼠免疫效果观察

将结核杆菌ＥＳＡＴ－６ 和ＭＰＴ－６４ 的编码基因分别插入真核表达载体ＪＷ ４３０３ 构建重组质粒，用重组质粒对４ 周龄的ＢＡＬＢ／Ｃ和Ｆ１ 代小鼠进行肌肉和皮内免疫，于末次免疫后１０ 天采血并分离血清，进行ＥＬＩＳＡ 检测。结果表明，小鼠能产生较强的体液免疫，特异性ＩｇＧ 平均水平分别为参考血清的２．２０ 倍和３．１９ 倍，且对两种品系小鼠进行的相同途径的免疫，其抗体水平差异不显著；而不同途径的重组质粒免疫，抗体水平略有差异。