MRE11-RAD50-NBS1复合物的功能与人类疾病的研究进展

生物体的DNA常遭受着来自体外和体内各种因素的攻击,其中DNA双链断裂(DSB)是严重的一种DNA损伤方式。为了保证遗传信息的稳定性,生物体自身存在应对DNA损伤的修复机制。同源重组修复是精确的修复DSB的方式,MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物是参与同源重组修复的关键蛋白,在不同物种之间存在保守性。从前关于MRN复合物的功能研究主要来源于酿酒酵母和线虫等低等生物,近些年来对哺乳动物MRN复合物的研究提示MRN复合物在高等动物DNA损伤修复中存在功能。本文综述了MRN复合物的组成和结构及其在DNA损伤同源重组修复中的功能,同时也介绍了MRN复合物异常所带来的人类疾病共济失调性毛细血管扩张综合征类似病症、奈梅亨断裂综合征和奈梅亨断裂综合征类似病症,并对这3类DNA损伤修复缺陷疾病的临床表型和相关小鼠模型研究进行了总结。

端粒长度、MRE11和Ku80在再生障碍性贫血中的表达及其与发病相关性研究

目的:检测再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者骨髓单个核细胞的端粒长度、端粒相关蛋白MRE11和Ku80基因表达水平,探讨它们与AA发病的关系。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测40例AA患者和20例正常对照者骨髓单个核细胞中端粒长度、MRE11和Ku80 mRNA表达情况,并进行相关性比较。结果:AA患者端粒长度、MRE11 mRNA和Ku80 mRNA表达水平均较正常对照组明显降低(P<0.05);年龄≥45岁的AA患者及正常对照组分别较年龄<45岁的端粒长度明显缩短(P<0.05);年龄<45岁及年龄≥45岁的AA患者分别与同年龄段的对照组相比,端粒长度均明显缩短(P<0.05);端粒长度与MRE11 mRNA表达水平(r=0.054,P>0.05)和Ku80 mRNA表达水平之间无相关性(r=0.235,P>0.05)。MRE11 mRNA表达水平与Ku80mRNA表达水平之间呈正相关(r=0.863,P<0.05)。结论:端粒长度的改变在AA的发病及疾病进展中可能发挥着重要作用,MRE11和Ku80表达的降低可能参与了AA的发病过程。

MRE11沉默对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU增殖和凋亡的影响

目的:观察shMRE11对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU细胞增殖和凋亡的影响,初步探索MRE11与肝癌发生发展的关系。方法:采用阳离子脂质体法将shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测转染前后BEL7402/5-FU细胞增殖情况;AnnexinV-FITC/PI双染法检测MRE11基因沉默对BEL7402/5-FU细胞凋亡的影响。结果:Real-time PCR及Western blot检测结果显示MRE11 mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0%、56.1%。MTT结果显示,shMRE11转染BEL7402/5-FU细胞后,shMRE11实验组与对照组相比细胞增殖速度减慢(P<0.05)。AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示shMRE11实验组的细胞凋亡指数增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:shMRE11干扰质粒能够抑制BEL7402/5-FU细胞增殖,促进细胞凋亡。

Mre11多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mre11蛋白,并制备出Mre11蛋白的多克隆抗体,为研究Mre11蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a-Mre11,然后转化受体菌E.coli BL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫兔以制备出Mre11多抗血清,最后采用western-blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达出了GST-Mre11融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mre11蛋白抗血清,IP、western-blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U2OS细胞株中Mre11蛋白,并能够正确清楚检测293T和U2OS细胞株中的Mre11表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mre11蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mre11蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。

MRE11基因在食管鳞癌中的表达

目的探讨MRE11 mRNA在食管癌组织中表达,并探讨其与肿瘤病理参数的相关性。方法收集22例明确诊断的食管癌中心组织及其相应癌旁组织,提取总RNA并逆转录成cDNA,采用SBYR Green适时荧光定量方法检测MRE11基因在22例食管鳞癌中心组织及其边缘组织mRNA水平的表达,并分析其与性别、年龄、临床分期、淋巴结转移与否以及肿瘤大小等的相关性。结果 MRE11 mRNA在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织(P=0.006)。虽然其表达与年龄、分化程度、有无淋巴结转移以及有无吸烟、饮酒史均无关,但与临床分期和肿瘤生长速度有关,T1和T2期患者的MRE11 mRNA的表达显著低于T3和T4期患者(P=0.000),肿瘤生长较慢的患者MRE11 mRNA的表达也低于生长较快的患者(P=0.012)。结论 MRE11的表达在食管鳞癌组织中的表达受到抑制可能为食管鳞癌发生的分子机制;且MRE11在较低的临床分期和生长速度较慢的食管鳞癌中表达低于较高的临床分期和生长速度较快的食管鳞癌中表达,MRE11可能在食管鳞癌的发生发展过程具有重要意义。

^(60)Coγ射线照射后大鼠涎腺中Mre11蛋白的表达与细胞凋亡的初步观察

目的:观察60Coγ射线照射对大鼠腮腺和下颌下腺Mre11蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法:取近交系Wistar成年大鼠60只,分为正常对照组(10只)及放射组(50只),放射组用60Coγ射线照射大鼠头颈部,总吸收剂量为15 Gy,每次照射3Gy,1次/d。照射3、6、9、12、15 Gy后2 h分别随机处死10只大鼠,用Western blotting法检测Mre11蛋白的表达;TUNEL法检测照射后细胞凋亡情况。结果:照射后唾液腺组织中Mre11蛋白的表达水平和细胞凋亡率均随放射剂量的增大而增高,Mre11蛋白的表达水平在腮腺照射9 Gy后和下颌下腺照射6 Gy后到达最大值,细胞凋亡率在腮腺照射9 Gy后和下颌下腺照射12Gy后到达最大值,之后开始逐渐减小,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:治疗量60Coγ射线照射后大鼠唾液腺组织中Mre11蛋白的表达水平和细胞凋亡率与放射剂量及唾液腺类型有关。

血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血免疫发病的诊断价值及治疗意义

目的探讨血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血免疫发病的诊断价值及治疗意义。方法采用回顾性研究方法,收集2011年8月到2018年2月在北京市大兴区人民医院诊治的再生障碍性贫血患儿42例作为观察组,同期留取42名儿童保健科体检者外周血作为对照组。采集所有小儿的外周空腹静脉血,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验定量检测法检测MRE11、TPO浓度,采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法检测IL-17、VEGF含量,采用qRT-PCR法检测Th 17TregRORΥ1、Foxp3表达水平并进行相关性分析。结果观察组的TPO、IL-17含量高于对照组,MRE11、VEGF含量低于对照组,对比差异有统计学意义(P<0.05)。观察组的Th 17Treg细胞中的RORΥ1表达水平高于对照组,Foxp3表达水平低于对照组,对比差异有统计学意义(P<0.05)。在观察组患儿中,直线相关性分析显示Th 17Treg细胞中的RORΥ1表达水平与TPO、IL-17、血小板计数、巨核细胞数呈正相关性(P<0.05),与MRE11、VEGF含量呈负相关性(P<0.05);Foxp3表达水平水平与TPO、IL-17、血小板计数、巨核细胞数呈负相关性(P<0.05),与MRE11、VEGF含量呈正相关性(P<0.05)。结论血清中MRE11、TPO、Th 17Treg、IL-17、VEGF在儿童再生障碍性贫血中呈现高表达情况,可互相影响,共同参与该病的免疫发病。

原发性胃癌中MRE11基因的突变筛查

目的:研究染色体不稳定性相关基因MRE11(meiotic recombination 11 homolog A)突变与原发性胃癌的相关性。方法:收集27例原发性胃癌病人的胃癌组织和对应的正常胃黏膜组织,并通过显微切割方法从胃癌组织中获取较纯胃癌细胞。设计扩增MRE11基因外显子的引物共20对,采用PCR产物直接测序方法在胃癌细胞和对应正常胃黏膜组织中对MRE11基因编码区进行突变检测,并运用CGH方法对存在突变的胃癌细胞进行染色体分析。结果:在27例原发性胃癌中,4例存在MRE11基因共4个体细胞水平的错义突变,其中3例为肠型胃癌。CGH显示该4例胃癌均存在5个以上基因组片断的获得或丢失事件。结论:MRE11基因突变可能在某些原发性胃癌的发生发展中起着重要作用,尤其是显示染色体不稳定性的肠型胃癌。

硫化叶菌超表达载体构建及Mre11的表达

利用araS启动子并在穿梭载体pZC1及pEXA的基础上构建硫化叶菌超表达载体pZC2,成功超表达了带有C端6×His标签序列的DNA双链断裂修复蛋白Mre11,进一步采用共纯化法鉴定到Mre11蛋白的作用配体Rad50,确定上述蛋白在高浓度盐(500mmol/L NaCl)中仍能形成MR复合体,表明该复合物在逆性条件下可能仍保持DNA断链修复的功能。进一步共纯化分析表明,基因组DNA片段是MR复合体形成的必需条件,在缺乏基因组DNA片段的情况下古菌分子伴侣蛋白结合并可能保护Mre11,该表达系统能够有效地应用于鉴定蛋白质的体内作用网络。

MRE11对食管鳞癌细胞凋亡和增殖的作用研究

目的探讨MRE11对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法MRE11 siRNA转染食管鳞癌细胞,下调MRE11表达;AKT激动剂SC79(0、0.1、0.5、1、1.5、1.8和2μg/ml)分别孵育24 h;构建过表达载体pcDNA.3.1-c-myc,与MRE11 siRNA共转染细胞;Western blot法检测食管鳞癌细胞Ec9706和TE-1中MRE11、p-AKT和c-myc的蛋白表达量;Annexin-V FITC/PI试剂盒检测Ec9706和TE-1细胞凋亡;Caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性;BrdU方法检测Ec9706和TE-1细胞增殖能力。结果Ec9706和TE-1细胞中MRE11的蛋白表达较人食管上皮细胞Het-1A明显升高;MRE11 siRNA转染后,Ec9706和TE-1细胞中AKT磷酸化水平及MRE11和c-myc的蛋白表达量显著降低;下调MRE11显著促进Ec9706和TE-1细胞凋亡,提高caspase-3活性,抑制食管鳞癌细胞增殖能力;下调MRE11后,SC79(1.5、1.8和2μg/ml)显著提高AKT磷酸化水平,同时逆转下调MRE11对c-myc蛋白表达量和细胞增殖的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用。过表达c-myc抑制下调MRE11对细胞增殖的抑制作用和对细胞caspase-3活性的促进作用。结论下调MRE11可通过调控AKT和c-myc抑制食管鳞癌细胞增殖及促进细胞凋亡。

MRE11基因变异致共济失调毛细血管扩张样障碍1型1例报告

共济失调毛细血管扩张症(AT)是一类罕见累及神经、血管、皮肤及内分泌等多系统疾病,该病典型临床症状为婴幼儿期发病的进行性小脑共济失调,眼球结膜和皮肤毛细血管扩张,免疫缺陷,反复发作的副鼻窦炎及肺部感染。而共济失调毛细血管扩张样障碍(ATLD)临床特征与AT相似,但ATLD与AT相比,无毛细血管扩张、甲胎蛋白升高和免疫球蛋白水平降低等神经系统外特征。女性患儿,11岁,间歇左膝关节疼痛3年余,运动、智力倒退2年余。临床发现:双手轮替试验阳性,闭目难立征阳性、指鼻试验阳性、跟-膝-胫试验弱阳性,左侧踝阵挛弱阳性,四肢肌力IV级,协调性差,步行时身体左右摇摆。全基因组测序发现MRE11基因两处变异即c.728 G>C及c.68 T>C,均尚未见报道。患儿诊断为ATLD,予电子生物反馈、低频脉冲、关节松动训练、牵引、作业疗法、手功能训练、运动课等康复训练康复后效果不佳。导致儿童运动发育落后和智力障碍的病因较多,及时基因检测可及早明确病因、产前咨询及母亲再孕时产前诊断,避免过度治疗及出生缺陷。

TPO、IL-1及MRE11在再生障碍性贫血患儿中的检测意义

目的 分析促血小板生成素(TPO)、白介素-1(IL-1)、减数分裂重组蛋白11(MRE11)在再生障碍性贫血(AA)患儿中的检测意义。方法 收集2018年3月至2021年3月西北妇女儿童医院收治的51例AA患儿(AA组),其中重型19例,轻型32例;另选取本院同期42例健康体检志愿者(对照组)。比较对照组与AA组TPO、IL-1、MRE11表达水平以及轻、重型患儿TPO、IL-1、MRE11表达水平、外周血血小板计数(PLT)、巨核细胞计数(MK);分析TPO、IL-1、MRE11与PLT、MK相关性以及三者对AA的诊断价值。结果 AA组TPO明显高于对照组,IL-1、MRE11明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。重型组患儿TPO明显高于轻型组,IL-1、MRE11、PLT、MK明显低于轻型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。TPO与PLT、MK为负相关(P<0.05),IL-1、MRE11与PLT、MK为正相关(P<0.05)。TPO+IL-1+MRE11联合检测对AA诊断的敏感度和特异度分别为89.40%、71.10%,AUC=0.906(95%CI:0.834~0.978),明显高于三者单独诊断(P<0.05)。结论 TPO在AA中明显升高,IL-1、MRE11明显降低,检测三者表达水平可为AA临床诊断、病情评估提供参考依据。

乙肝病毒感染导致Mrell下调及基因组断裂

【目的】乙肝病毒的持续感染与肝细胞癌的发生密切相关。本文探讨了乙肝病毒感染后导致宿主蛋白Mre11的变化,并研究这种蛋白的变化可能导致肝癌发生的机制。【方法】本文通过Western blot检测了乙肝病毒感染HL7702细胞及肝癌组织标本的Mre11蛋白的变化,并且通过RNA干涉的方法干扰了Mre11的表达,用连接介导PCR检测基因组的变化。【结果】本研究发现乙肝病毒感染细胞导致Mre11表达下调,肝癌组织也可以发现Mre11表达下调;下调Mre11表达可以导致细胞基因组的断裂增多。【结论】HBV感染导致Mre11表达下调导致基因组不稳定,这可能与HBV感染导致细胞恶性转化相关。

X射线照射对MRE11在鼻咽癌细胞株CNE1中表达的影响

目的 研究X射线照射后肿瘤细胞中MRE11基因及其蛋白表达的规律,并探讨其与肿瘤放疗失败的相关性,为提高肿瘤放射治疗疗效开辟新途径,提供新的靶点。方法 选取人鼻咽癌CNE1细胞株进行体外培养及X线照射。按单次照射0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy剂量分组,照射后4 h收集,利用RT-PCR技术检测MRE11 m RNA的表达;CNE1细胞株单次照射4 Gy于0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点收集固定,利用免疫荧光技术检测MRE11蛋白的表达,并采用Image-Pro Plus 5.0软件分析测定各组荧光的平均光密度值(m OD)。结果 RT-PCR检测CNE1细胞株分别经0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy X线照射后4 h,各组之间MRE11 m RNA表达无统计学差异。免疫荧光技术检测CNE1细胞株经4 Gy X线照射后0 h、1.5 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点MRE11蛋白的表达,荧光强度先增强后减弱,4 h荧光强度最强。结论 CNE1细胞株MRE11 m RNA的表达与X线照射剂量递增无相关性。但CNE1细胞株经X线照射后MRE11蛋白的表达随时间的延长先增强后减弱,且在照射4 h表达最强,24 h后恢复到未照射水平。

核酸酶与自身免疫性疾病

核酸酶在DNA损伤修复和基因组稳定性中起重要作用,而近年发现一些核酸酶的功能异常与多种自身免疫性疾病的发病机制相关。现重点就核酸酶TREX1和Mre11复合物(MRN)等在常见的自身免疫性疾病中的研究进展做一综述。

MRN复合物(MRE11/RAD50/NBS1)生物学作用的研究进展

双链DNA损伤（double strand breaks,DSBs）是导致基因组不稳定和细胞死亡的主要原因。MRE11/RAD50/NBS1是检测和修复DSBs的重要复合物[1]。细胞代谢过程中的复制、有丝分裂及遗传毒性化学物质和放射治疗均能引起DSBs[2-3]。MRN复合物在DSBs修复过程中发挥重要作用,参与起始修复、

MRE11参与炎症小体信号通路激活的初步研究

目的探究减数分裂重组蛋白11同系物A(MRE11)在不同刺激物诱导下炎症小体激活中的作用和地位。方法利用不同刺激物,如Poly(I∶C)、Poly(d A∶d T)、E.coli g DNA、293T g DNA和CPPD以及生殖疱疹病毒(HSV)等处理单核巨噬细胞THP-1,通过IL-1β酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)筛选出诱导激活炎症小体的有效刺激物;合成si MRE11干扰小RNA,转染THP-1细胞,免疫印迹检测MRE11干扰下调效率;利用筛选到的阳性刺激物处理MRE11干扰下调的细胞,采用ELISA和免疫印迹方法检测MRE11对细胞分泌炎性因子IL-1β水平和前胱天蛋白酶(pro-caspase)-1切割的影响。结果在MRE11干扰下调的THP-1细胞中,Poly(I∶C)、Poly(d A∶d T)、E.coli g DNA和293T g DNA刺激激活细胞分泌的IL-1β水平以及前胱天蛋白酶-1切割的水平均有不同程度降低。结论MRE11参与由DNA以及RNA刺激激活的炎症小体信号通路。

Mre11-Rad50-Nbs复合物在果蝇胚胎发育早期参与端粒的保护

应用果蝇模式生物系统,我们发现在胚胎发育早期,端粒的保护依赖于Mre11-Rad50-Nbs(MRN)复合物。

^(60)Coγ射线照射大鼠涎腺组织后Mrell蛋白表达的初步研究

目的:检测Mre11基因及其蛋白在放疗后的大鼠腮腺和颌下腺组织中的表达变化。方法:选取近交系雄性Wistar大鼠60只,按单次照射0 Gy,3 Gy、6 Gy、9 Gy、12 Gy、15 Gy剂量分成6组,用60Coγ射线照射大鼠头颈部,2h后收集大鼠两侧腮腺和颌下腺组织。用透射电镜观察涎腺上皮细胞超微结构变化;用RT-PCR检测Mre11的基因表达情况;用免疫组化检测Mre11蛋白表达情况。结果:透射电镜显示:放射后大鼠腮腺腺泡细胞胞质和胞膜均出现不同程度的损坏,随着剂量的增加,这种损坏逐渐加剧,未见到再生、恢复的变化。颌下腺和导管变化不明显。RT-PCR检测Mre11mRNA表达无统计学差异。免疫组化检测Mre11蛋白表达有统计学差异。结论:治疗剂量的60Coγ照射对正常涎腺组织呈不可逆的损伤,损伤的程度具有剂量依赖性;大鼠涎腺细胞Mre11mRNA的表达无剂量依赖性;大鼠涎腺细胞Mre11蛋白的表达与辐射剂量以及组织类型有关,随剂量的增加先增强后减弱。

葡萄籽原花青素对人宫颈癌细胞的辐射增敏作用

目的:研究葡萄籽原花青素对人宫颈癌Hela细胞重离子辐射的增敏作用。方法:SRB法检测葡萄籽原花青素对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用,集落形成法检测其对重离子辐射的增敏作用,实时荧光定量检测葡萄籽原花青素对Hela细胞MRE-11基因mRNA的表达影响。结果:葡萄籽原花青素对人宫颈癌Hela细胞呈现剂量依赖性杀伤,但整体抑制率较低,IC50值为110.3μg/ml,单独应用抗肿瘤效果较弱;30μg/ml葡萄籽原花青素预处理后,人宫颈癌Hela细胞对重离子辐射的敏感性增加,增敏比为1.25;单独重离子辐射后,人宫颈癌Hela细胞Mre-11 mRNA表达显著上调,30μg/ml葡萄籽原花青素预处理可以降低由重离子辐射引起的Mre-11 mRNA表达的上调。结论:葡萄籽原花青素具有对人宫颈癌Hela细胞重离子辐射增敏作用,可能通过抑制Mre-11基因的表达而抑制DNA损伤修复。