干旱胁迫下披碱草属种间杂种F1的DNA甲基化MSAP分析

为了研究披碱草属种间杂种抗旱性优势的遗传机理,以加拿大披碱草(J1)、老芒麦(L1)及其种间杂种F1为试验材料,经干旱胁迫处理,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法,探究干旱胁迫后亲本及种间杂种F1的DNA甲基化变化规律。结果表明,亲本材料L1和J1的DNA平均甲基化水平分别为45.41%和59.53%,杂种F1的DNA甲基化水平为44.24%,说明杂种在形成过程中发生了DNA去甲基化作用。全甲基化在杂交种的DNA甲基化模式中占主导地位。干旱胁迫前亲本L1、J1和杂种F1的DNA甲基化程度分别为32.73%、41.54%和28.00%,杂种F1甲基化水平为亲本材料的75.40%;干旱胁迫后各材料的DNA甲基化程度均增加,平均增幅分别为14.99、20.44和19.78个百分点,说明干旱胁迫对不同材料DNA甲基化水平均有明显影响,且具有特异性。杂种F1的抗旱性最强,其DNA甲基化水平低于亲本,说明杂交种的抗旱性与DNA甲基化水平存在一定的负相关。

黑果枸杞MSAP技术体系的构建

为利用甲基化敏感多态性扩增技术(MSAP)构建黑果枸杞MSAP技术反应体系,本试验采用CTAB法提取黑果枸杞DNA,通过双酶切、预扩增和选择性扩增对16对引物的多态性进行初步筛选并构建MSAP技术体系。结果表明:双酶切进行12 h,DNA模板能够酶切完全;预扩增反应产物条带集中在250~1000 bp处,选择性扩增可筛选出6对引物组合,条带明显。本研究为后续黑果枸杞DNA甲基化水平的相关分析研究奠定了基础。

基于MSAP工艺的封装基板的微孔导通技术研究

封装基板具有高密度、高精度、小型化及薄型化的特点。为实现上述产品特点,封装基板采用微孔导通及任意层互连技术,其孔径孔盘约50/100μm。在MSAP工艺下,实现微孔导通及任意层互连大致分三个步骤,分别是激光钻X型孔/盲孔、微孔与孔盘对准及叠孔垂直对准、图形填孔电镀。本文以50/100μm孔径孔盘微孔导通技术为研究对象,从超薄铜箔直接烧蚀工艺的激光钻孔参数、图形对位方式以及薄板图形填孔方式及参数等方面展开测试,最终获取相关制程参数,实现微孔导通技术,为量产封装基板奠定基础。

蒙古黄芪MSAP反应体系的建立与优化

目的利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术开展蒙古黄芪表观遗传多样性研究,建立并优化蒙古黄芪MSAP技术的反应体系。方法以蒙古黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)为材料,采用单因素与正交设计法优化蒙古黄芪甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术各反应体系的关键影响因素,建立蒙古黄芪MSAP反应最佳体系。结果20μL双酶切反应体系中,加入EcoRⅠ和MspⅠ/Hpa II各0.5μL,于37℃水浴酶切6 h可酶切完全;最佳连接体系25μL,包含10μL酶切产物、0.2μL T4 DNA Ligase、1μL EcoR I-adapter、1μL Hpa II/Msp I-adapter、2.5μL 10×T4 Buffer;最佳预扩增反应体系25μL,包含2.5μL 10×PCR buffer、0.5μL dNTP、2.0μL连接产物、0.3μL Taq DNA polymerase、上下游引物各1.0μL;最佳选择性扩增体系25μL,包括2μL稀释20倍的预扩增产物,1.0μL 10×PCR buffer,1.0μL dNTP,0.2μL Taq DNA polymerase,0.8μL引物。结论优化后的MSAP体系经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示扩增产物多态性好、条带清晰,表明该体系稳定、可重复,为后续进行蒙古黄芪DNA甲基化分析奠定了基础。

IC载板mSAP工艺的化学镀铜性能研究

mSAP工艺是在半加成法的基础上进行改良而得的一种制作精细线路的IC载板制作技术,随着轻薄化的发展及国产化趋势,IC封装载板在国内的需求也越来越大。本文介绍一种性能优异、高效、低应力及不含氰化物的环保型mSAP化学镀铜解决方案,实现了BT类载板的mSAP工艺金属化制程。研究了添加剂对化学镀铜结晶形貌的影响,同时介绍使用我司的化学镀铜和电镀药水进行BT类载板的孔金属化情况,并测试了其载板的可靠性。

基于mSAP工艺转移加工精细线路

改良半加成制程(mSAP)广泛应用于IC载板领域。与减成法制作图形不同,mSAP通过电镀工艺加成制作图形,可以实现更加紧密的布线,使其逐渐在制作高精密电路板领域得到应用。然而mSAP还存在许多技术难点,闪蚀工艺就是其中之一,电镀后对基铜的闪蚀直接决定了线路的品质。由此本文探索了一种新的思路,电镀后进行压合再闪蚀,在mSAP基础上对图形进行转移加工,有望拓展mSAP的应用前景。

不同倍性西瓜基因组DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥重要作用。本研究以不同倍性(2x、3x、4x)西瓜为试材,采用基于DNA甲基化敏感酶的扩增多态性分析(Methyla-tion-Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)方法,在全基因组水平上探究西瓜同源多倍化过程中DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。研究中选用23对选扩引物,共检测到1883个基因位点。二倍体、三倍体、四倍体中检测到的位点数分别为647、655和581;其中发生甲基化的位点数分别为181、150和159,相应的扩增总甲基化率分别为28.0%、22.9%和27.4%;全甲基化位点数分别为121、80和82,相应的全甲基化率分别为18.7%、12.2%和14.1%。进一步对不同倍性西瓜DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示:四倍体西瓜与二倍体西瓜相比有超过半数的位点(54.4%)DNA甲基化模式发生了变化,其与三倍体西瓜相比也有近一半的位点(45.4%)DNA甲基化模式发生了变化,并且变化趋势都以四倍体西瓜甲基化程度升高为主;而三倍体西瓜与二倍体西瓜相比,虽然也有41.6%的位点DNA甲基化模式发生了改变,但变化趋势以三倍体西瓜甲基化程度降低略占优势;与之相似,三倍体西瓜与四倍体相比较,甲基化的变化趋势也是以三倍体西瓜甲基化程度降低为主。以上结果表明:不同倍性西瓜中DNA甲基化事件虽均有发生,但不论是从总甲基化率还是全甲基化率来看,DNA甲基化水平与倍性高低关系不大,三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征。DNA甲基化模式的分析也表明,与二倍体及四倍体西瓜相比,三倍体西瓜DNA甲基化模式的调整主要以去甲基化为主。显示出三倍体西瓜基因组独特的DNA甲基化特征。本研究为进一步从表观遗传学的角度探讨西瓜的三倍体优势及西瓜同源多倍化的机制奠定了基础。

应用MSAP方法检测鸡不同组织基因组的甲基化状态

以白洛克肉鸡和白来航蛋鸡及其杂交F1代基因组为实验材料,应用甲基敏感扩增片段多态性方法(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)检测了鸡肌肉、心脏、肝脏和肾脏4个不同组织基因组在CCGG位点的甲基化状态,分析了不同组织的DNA甲基化水平及组织特异性甲基化模式。研究发现:肌肉组织的甲基化水平约为29.7%,肝脏组织约为27.5%,心脏组织约为27.5%,肾脏组织约为26.1%;在鸡3个不同群体及其中3个不同组织间,基因组甲基化程度差异显著(P<0.05);在检测的4个组织中,CCGG序列的全甲基化位点少于半甲基化位点,与植物的相关研究不一致;分离及鉴定了2个组织特异的甲基化片段。结果表明:鸡不同组织基因组的甲基化状态是不同的,同一组织的甲基化水平在不同的群体是不同的,而不同组织甲基化水平的排序在不同的群体是不一致的。这些结果揭示遗传效应可能影响个体的组织甲基化水平。

运用MSAP研究镉胁迫对拟南芥幼苗基因甲基化的影响

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,并在环境胁迫响应中起重要作用。运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究0、0.5、1.5、5.0 mg·L-1Cd2+处理对拟南芥幼苗全基因组DNA甲基化水平的影响,结果表明:(1)不同浓度镉处理19 d后,叶片数、地上部鲜重无明显变化,但根长受到显著抑制;(2)选取10对引物扩增DNA酶切产物,所得三个镉处理造成的拟南芥基因组MSAP%均高于对照(35%);(3)随着镉处理的增大,拟南芥基因组甲基化(M)型条带依次减少,去甲基化(D)型条带逐渐增加,并且条带亮度也有所变化;(4)将特异性条带克隆测序后发现,mRNA、假设蛋白、表达蛋白、用于编码假定蛋白的mRNA序列V型质子ATP酶亚组、叶绿体中光合体系II CP47基因、叶绿体DNA、rRNA重复单元、核糖体蛋白等多种序列均存在甲基化修饰现象。这些特异序列可为我们寻找镉胁迫的生物标记物及胁迫响应的机理研究提供一定的依据。

叶锈菌胁迫下的小麦基因组MSAP分析

内源DNA甲基化是真核生物表观遗传调控的重要组成部分,在真核生物的基因表达调控中具有重要的作用。生物胁迫为植物提供一种内在的表观遗传进化动力。研究生物胁迫下DNA甲基化的变异模式,有助于全面理解DNA甲基化的表观调控生物学功能。小麦近等基因系TcLr19、TcLr41及其感病亲本Thatcher在苗期对叶锈菌生理小种THTT、TKTJ分别表现为小种特异性抗病反应和感病反应。文章利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术分析了小麦的甲基化水平,同时比较了苗期在生物胁迫前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式。用60对MSAP引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选,没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异,结果初步表明,叶锈菌并没有诱导稳定且特异的植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化,但发现TcLr41及其感病亲本Thatcher之间存在表观遗传学差异。

不同生理年龄毛竹DNA甲基化的MSAP分析

为分析竹子年龄变化与基因组DNA甲基化之间的相关性,以5年、31年和>60年起源(从种子萌发年龄算起)的毛竹当年生叶片为材料,采用35对引物对其进行MSAP检测。结果表明:3个年龄段的总甲基化率和全甲基化率分别为24.44%、28.21%、32.12%和16.57%、19.41%、21.23%;发生DNA甲基化的变异位点为52.3%,去甲基化变异位点为10.3%。可以看出,随着年龄的增加,毛竹基因组DNA甲基化敏感多态性呈上升趋势。总甲基化率单因素方差分析的结果表明相同年龄的毛竹个体间没有差异(P=0.307>0.05),而不同年龄间的差异达极显著水平(P<0.001)。同时,对所用引物组合进行分析后发现有6对引物(E3/HM2、E3/HM6、E3/HM7、E4/HM5、E4/HM6和E5/HM5)扩增出的位点与总趋势显著相关,为进一步开展深入研究奠定基础。

盐胁迫下红花基因组DNA甲基化的MSAP分析

以红花幼苗为研究材料,经200mmol.L-1 NaCl溶液分别处理4、8、12h,以未经盐胁迫处理为对照(CK),对DNA甲基化变化特征进行MSAP(甲基化敏感扩增多态性)分析。选用13对选扩引物,共检测到3 140个基因位点。甲基化水平分析表明,CK,4、8、12h处理样本中总甲基化率分别为31.8%、27.1%、31.0%和31.3%。进一步对不同处理时间红花基因组DNA甲基化模式的变化特征进行分析表明,NaCl处理4h后DNA的去甲基化模式调整占优势,而处理8h及12h后DNA甲基化水平恢复到CK水平,甲基化及去甲基化模式调整基本一致。上述结果显示,盐胁迫条件下红花基因组DNA甲基化状态发生了一定变化,并且这种变化与盐胁迫程度相关,推测DNA甲基化修饰可能参与了红花的盐胁迫应答。

丹参MSAP分子标记技术体系的优化及其应用

以陕西省野生丹参为材料利用正交设计对MSAP预扩增和选择性扩增体系中关键因素优化筛选,以建立适合丹参的MSAP反应体系,并用于5个野生丹参居群表观遗传多样性分析.结果表明:25μL MSAP双酶切反应体系中加入EcoRⅠ和MspⅠ各10 U,37℃酶切8 h,酶切较充分;最佳预扩增反应体系25μL,包含连接产物2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)1.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.4μL,上下游引物E00/HM00(50ng/μL)各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系25μL,包含稀释100倍的预扩增产物1.5μL,Mg2+(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.1μL,上下游引物E-ACG/HM-CAA(50 ng/μL)各0.8μL.选用5对引物组合对5个野生丹参居群的50个单株进行表观遗传多样性分析,平均DNA甲基化多态性谱带为95.48%;UPGMA聚类分析结果表明,50个丹参单株在相似性系数0.58处可分为3大类.

野生和“黄海1号”中国明对虾不同组织基因组DNA的MSAP分析

为了从表观遗传学角度讨论中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)野生群体和人工选育新品种"黄海1号"不同组织间甲基化水平和多态性差异,应用甲基化敏感扩增多态性(mehylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分别对野生群体组中国明对虾和"黄海1号"肌肉、鳃、血液3种组织样品基因组DNA的CCGG甲基化水平进行对比分析,试图从表观遗传学角度探讨影响中国明对虾生长性状的分子机制。采用30对引物进行选择性扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)带型结果显示,野生群体组中国明对虾肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为23.1%,22.3%和19.7%;而"黄海1号"肌肉、鳃和血液的甲基化比例分别为21.4%、19.6%和18.9%。野生群体组中国明对虾和"黄海1号"同一组织间的甲基化水平和甲基化多态性水平不同,肌肉、鳃和血液不同组织间的甲基化水平和甲基化多态性水平亦不同。DNA甲基化多态性带型分析显示,鳃组织的甲基化水平和多态性水平在野生群体组中国明对虾和"黄海1号"间变化趋势最大,肌肉最稳定。本研究旨为甲基化修饰与中国明对虾生长性状间的相关性研究提供依据。

刺参(Apostichopus japonicus)不同组织基因组甲基化状态MSAP分析

利用MSAP技术分析成体刺参的呼吸树、肠、肌肉和体壁等组织的基因组DNA甲基化水平,获得了四个组织基因组甲基化率。甲基化水平由高到低依次是呼吸树、体壁、肌肉和肠,分别是35.77%、33.51%、32.72%和28.0%,其中全甲基化位点各占19.46%、18.39%、19.18%和15.97%。统计学分析结果显示肠组织的甲基化水平与其它组织的差异显著(P<0.05),其余三个组织间差异不显著(P>0.05),但呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P<0.05)。由MSAP分析差异位点克隆得到四个甲基化特异性片段,经测序分析功能未知,推测为刺参基因足非编码区或新功能基因序列。

大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA胞嘧啶甲基化状态的MSAP分析

应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术分析了大花蕙兰(Cymbidium hybridium)授粉前后子房DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。采用72对引物进行选择性扩增,共得到5892条带,其中748条带为甲基化多态性带。结果显示DNA甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发生频繁,从授粉前后子房的总扩增位点甲基化水平(14%和11.4%)和全甲基化率(9.5%和7.8%)来看,授粉后都略低于未授粉子房,表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化。除甲基化水平有变化外,大花蕙兰子房授粉前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,共检测到14种带型,分为两大类(Ⅰ和Ⅱ型)。其中,授粉前后DNA甲基化状态保持不变的位点较少,只占25.6%,归为Ⅰ型;大部分检测位点(占74.4%,归为Ⅱ型)的DNA甲基化模式在授粉前后存在显著差异。上述结果表明,大花蕙兰子房发育过程中以DNA甲基化为代表的表观遗传调控起重要作用。本研究的开展将促进对与大花蕙兰子房发育相关的甲基化差异片段及受DNA甲基化调控的关键基因的克隆,进而为从表观遗传学这一新角度揭示大花蕙兰子房发育的分子机制奠定基础。

毛泡桐二倍体及其同源四倍体的AFLP和MSAP分析

分别用AFLP和MSAP分子标记技术,研究了毛泡桐二倍体及其同源四倍体幼苗DNA碱基序列及其甲基化的变化。结果表明,毛泡桐二倍体及其同源四倍体DNA碱基序列在AFLP水平上没有发生变化;在MSAP扩增电泳凝胶上,毛泡桐二倍体及其同源四倍体分别检测到2 262和2 180个扩增位点,DNA甲基化位点占总扩增位点的比例分别为35.32%和38.58%,其中DNA全甲基化比例则为12.86%和14.13%;毛泡桐同源四倍体DNA甲基化和去甲基化频率高于其二倍体,总DNA甲基化多态性低于二倍体。

虾夷扇贝选育群体与野生群体基因组DNA甲基化的MSAP分析

基因组DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要手段之一,在水产科学领域得到越来越广泛的应用。为从表观遗传学角度探讨虾夷扇贝选育群体-"玉贝"和普通虾夷扇贝群体的DNA甲基化差异,本文运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术分析了两群体的DNA序列中CCGG位点的甲基化情况。结果表明,筛选得到11对引物组合能够在两个群体中得到稳定扩增、清晰且多态性丰富的片段;11对引物在"玉贝"和对照群体中分别共检测到1432和1442个位点,其中发生甲基化的位点分别为306和341个,总甲基化率分别为21.5%和23.65%,"玉贝"总甲基化率下降2.15%;全甲基化位点分别为152和236个,全甲基化率为10.68%和16.37%,"玉贝"全甲基化率下降5.69%;半甲基化位点分别为154和105个,半甲基化率为10.82%和7.28%,"玉贝"半甲基化率上升3.54%;"玉贝"群体的甲基化多态性条带所占比例高于对照群体,分别为31%和29.167%,尤其是B类型条带链,"玉贝"群体明显高于对照群体。这说明,通过对虾夷扇贝生长和耐热性状的累代选育导致了DNA甲基化水平和模式的改变,本研究为进行虾夷扇贝抗逆基因的筛查提供了参考数据,丰富了表观遗传学在扇贝中的研究资料。

黑麦基因组DNA甲基化修饰位点的MSAP分析

为了获得黑麦基因组DNA甲基化修饰水平、模式及位点等表观遗传信息,采用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于黑麦基因组的"甲基化敏感扩增多态性"(Methylation sensitive amplification polymor-phism,MSAP)分析体系,在全基因组水平检测黑麦DNA甲基化修饰位点。以12对MSAP引物进行选择性扩增,共检测到甲基化修饰位点226个,"CCGG/GGCC"位点甲基化修饰比例为51.72%。对部分黑麦基因组甲基化修饰位点进行回收,最终分离了22条存在甲基化修饰的基因组DNA序列。BLAST比对分析结果表明,黑麦基因组中包括转座子序列、散在重复序列以及单拷贝蛋白质编码序列在内的多种类型DNA序列中均存在DNA甲基化修饰现象。同时发现,在甲基化检出序列中都存在明显的"CpG"二核苷酸成簇富集现象,这些区域分布与MSAP分析结果相一致。在此基础上,对应用MSAP技术分离黑麦基因组DNA甲基化修饰位点的有效性以及黑麦基因组序列中DNA甲基化修饰潜在位点分布特征和生物意义进行了讨论。

MSAP技术及其在植物上的应用

DNA甲基化在植物的很多生命过程中具有重要作用,检测DNA甲基化的技术应运而生。依据对DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶,在AFLP技术的基础上发展而来的MSAP技术可以方便的检测全基因组范围内胞嘧啶甲基化模式及程度。该文对MSAP技术的原理、特点、基本程序及应用进行了阐述。