双重突变特异性引物PCR检测Leber遗传性视神经线粒体突变

目的建立双重MSP-PCR检测Leber2遗传性视神经病变线粒体突变的方法。方法收集视神经病变者109例,应用双重MSP-PCR分析其线粒体DNA11778和3460的突变情况,并用或序列测定比较分析。结果用双重MSP-PCR分别检测出线粒体DNA11778和3460突变36例和1例,其正确率与SSCP及序列分析一致。结论双重MSP-PCR是检测线粒体DNA11778和3460突变的特异、简便的方法,适用于常规检测和研究。

GSTM1基因多态性及启动子甲基化在结肠癌细胞系中的研究

目的研究参与内毒物代谢的重要酶谷胱甘肽-S-转移酶M1(glutathione-s-transferase M1,GSTM1)在结肠癌细胞系中的基因表达状况与其遗传基因型及启动子甲基化的关系。方法采用多重PCR方法检测GSTM1基因型,甲基化特异PCR(MSP)方法检测GSTM1基因启动子甲基化状态;用5-aza-dC处理结肠癌细胞系,RT-PCR方法检测GSTM1基因转录水平。结果结肠癌细胞系HT29、SW480、SW1116为GSTM1非空白基因型,而HCT116、Lovo、Colo结肠癌细胞系为GSTM1空白基因型。MSP检测发现SW1116细胞中GSTM1基因主要呈非甲基化状态,其他5个细胞系中呈甲基化状态,而且基因表达缺失。经5-aza-dC处理后,HT29和SW480细胞的GSTM1基因表达复活,而HCT116、Lovo、Colo细胞中GSTM1仍无扩增。结论 GSTM1基因转录受到遗传基因型和表观遗传启动子甲基化双重调控。

膀胱癌中BLU基因启动子高甲基化和转录水平

目的研究膀胱癌中BLU基因启动子甲基化状态、转录水平及其意义。方法采用甲基化特异性PCR(meth-ylation specific PCR,MSP)技术和逆转录PCR(RT-PCR)技术分别检测54例膀胱癌患者癌组织及45例相应癌周正常组织、3例非肿瘤患者的正常膀胱组织中BLU基因启动子甲基化状态和转录水平。结果①31.5%(17/54)膀胱癌组织中BLU基因高甲基化,相应癌周正常组织和3例正常膀胱组织均未发现该基因高甲基化改变;②甲基化状态与膀胱癌临床病理参数无明显相关性;③在45例膀胱癌组织中,BLU表达缺失率为42.2%(19/45);④BLU mRNA表达缺失与肿瘤临床分期和病理分级相关(P<0.05);⑤在启动子高甲基化的膀胱癌中,92.3%(12/13)BLU mRNA表达异常下调或缺失。结论膀胱癌中频繁发生BLU基因的高甲基化和mRNA表达缺失,其高甲基化可能是基因转录失活的重要原因。

DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化与脑胶质瘤

目的在许多肿瘤中发现启动子区过甲基化而导致O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的转录失活,本研究拟从胶质瘤患者肿瘤组织和其对应血清中MGMT基因启动子过甲基化是否有一致性对MGMT基因启动子甲基化进行研究。方法采用甲基化特异性PCR法(MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化水平的检测。结果27例胶质瘤组织中有14例(51.9%)MGMT甲基化扩增阳性,13例(48.1%)为MGMT去甲基化扩增阳性。相应的血清中有13例(48.1%)MGMT甲基化扩增阳性,14例(51.9%)MGMT去甲基化扩增阳性(P<0.05)。结论胶质瘤患者肿瘤组织和其对应的血清中MGMT基因启动子甲基化状态具有显著相关性。测定血清中MGMT基因启动子区的甲基化状态能反应胶质瘤组织中MGMT基因启动子区甲基化状态。MSP是检测MGMT基因启动子区甲基化灵敏和可靠的方法,可以指导临床脑胶质瘤的个体化化疗方案的设计。

食管鳞癌细胞株金属硫蛋白3基因CpG岛超甲基化的临床意义

目的探讨金属硫蛋白3(MT-3)基因CpG岛超甲基化与食管鳞状细胞癌的关系。方法选取TE-1、TE-13、TTN和ECA-109四种食管鳞癌细胞株,用甲基化特异性聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应技术,在5-氮2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后,对各细胞株的MT3基因CpG岛超甲基化及mRNA表达进行比较。结果四种食管鳞状细胞癌细胞株的MT3基因均存在不同程度的CpG岛超甲基化。5-aza-CdR处理后超甲基化状态解除,mRNA表达明显提高(P均<0.05)。结论食管鳞状细胞癌细胞株中MT3基因CpG岛超甲基化可抑制其mR-NA表达;超甲基化解除后MT3基因的mRNA表达相应升高。

胃肠道恶性肿瘤中Runx3基因甲基化研究

目的:通过检测胃肠道恶性肿瘤细胞系中Runx3基因启动子区域甲基化状态及Runx3基因表达情况,探讨Runx3基因启动子区域甲基化及表达在胃肠道恶性肿瘤中发生和发展过程中的意义。方法:采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对9种胃癌细胞系和11种结直肠癌细胞系中Runx3基因启动子区域甲基化进行检测,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runx3 mRNA的表达情况。结果:在7种胃癌细胞系和6种结直肠癌细胞系中,Runx3基因启动子区域过度甲基化;RT-PCR结果显示,在20种胃肠道恶性肿瘤细胞系中有15种细胞系Runx3基因未表达。结论:Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与胃肠道恶性肿瘤的发生发展密切相关,可作为胃肠道恶性肿瘤早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。

MSI-H单发性肠癌中hMLHI基因启动区甲基化测定在癌症临床诊断和早期治疗中的作用和意义

目的探讨MSI,MMR和hMLHI基因启动区甲基化之间的关系以及可能存在的致癌机制。强调甲基化测定在癌症的早期诊断与跟踪治疗中所应引起的重视。方法详细阐述了从病人肿瘤组织样品中基因组DNA的粹取以及MSP的具体测定方法步骤,以及引物的选用。结果90%的MSI-H单发性肠癌病人存在着hMLHI基因启动区甲基化现象。结论在MSI-H型的单发性肠癌中,hMLHI基因启动区甲基化是造成MMR缺损的原因。在这个背景下,一个非遗传性的后生环境也许会导致在肿瘤中多种遗传性变化。该结论将为抗癌药物的设计提供重要信息。DNA甲基化测定是一个很有潜力的癌症生化诊断标志,它不但在临床诊断与跟踪治疗过程中发挥着作用,同时也将一步步揭示致癌的机制。

猪IGFBP2基因多态性及其对苏姜猪肉质性状的影响

【目的】探讨IGFBP2基因潜在的遗传变异及其与苏姜猪肉质性状之间的关系。【方法】采用PCR-RFLP技术检测IGFBP2基因在苏姜猪、姜曲海猪、杜洛克猪中的MspⅠ酶切遗传多态性,采用单因素方差分析法分析该多态位点对苏姜猪肉质性状的影响。【结果】在3个猪种试验群体,IGFBP2基因第2内含子内均发现了1个MspⅠ酶切多态性,存在A、B等位基因,AA、AB、BB基因型,优势等位基因为B,优势基因型为AB,多态信息含量均呈现中度多态。苏姜猪试验群体IGFBP2基因AA、AB型个体大理石纹显著高于BB型(P<0.05),AA型个体五分制肉色和色差仪测得的a值均显著高于AB、 BB型(P<0.05)。【结论】苏姜猪试验群体IGFBP2基因第2内含子内PCR-RFLP-MspⅠ多态性与部分肉质性状间存在一定程度的显著性相关,可以作为与猪肉质性状相关的候选基因加以研究。

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法。方法以肺癌细胞株NCI-H460作为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆。用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测。以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量。结果实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆)。15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%)。5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml。结论实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强。

上皮钙粘蛋白基因甲基化在胃癌中的研究

目的:研究胃癌组织中上皮钙粘蛋白(E-CD)基因启动子区5'CpG岛甲基化状况,揭示胃癌发生、发展过程中的分子水平变化和可能作用机制。方法:应用甲基化特异性PCR检测41例胃癌手术标本及同一病例正常胃黏膜组织中E-CD基因启动子区5'CpG岛甲基化水平。结果:E-CD基因启动子区甲基化阳性率在胃癌中显著高于正常胃黏膜,与胃癌的分型、细胞分化程度、胃壁浸润深度、淋巴结转移、TNM分期明显相关。结论:E-CD基因启动子区甲基化水平可作为较早期预测胃癌浸润、转移程度,评价预后的有效指标。

甲状腺乳头状癌组织中NIS和RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨甲状腺乳头状癌及癌旁组织中,甲状腺功能基因钠碘转运体基因(NIS)和甲状腺抑癌基因RAS相关区域家族1A基因(RASSF1A)基因启动子甲基化改变的特点及其相关性。方法采用甲基化特异性PCR方法分别检测NIS和RASSF1A基因启动子的甲基化状况。结果①甲状腺乳头状癌组织中NIS基因启动子甲基化显著高于癌旁组织(P<0.05)。②甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化显著高于癌旁组织(P<0.05)。③功能基因NIS启动子甲基化发生显著高于抑癌基因RASSF1A基因启动子的甲基化(P<0.05);功能基因NIS和抑癌基因RASSF1A的启动子的甲基化呈正相关(rs=0.41,P<0.05)。结论 RASSF1A基因和NIS基因启动子异常甲基化是甲状腺乳头状癌发生或发展过程中的分子事件,两者的基因甲基化提示呈一定正相关,可能相互影响共同参与了甲状腺乳头状癌发生、发展过程。

哈萨克、汉族食管癌p16基因甲基化及其表达的研究

目的探讨新疆哈萨克族、汉族食管癌患者p16基因的甲基化状态及其与食管癌发生的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)的方法,检测哈萨克族(36例)、汉族(35例)食管癌患者及正常人群对照组p16基因的甲基化状态,分析其与年龄、性别、淋巴结转移、分化程度及临床病理分期等的关系。结果 36例哈萨克族食管癌癌组织、癌旁组织的甲基化率分别为44.4%、13.9%,正常人群对照组的甲基化率为2.8%;35例汉族食管癌癌组织、癌旁组织的甲基化率分别为42.9%、14.3%,正常人群对照组的甲基化率为2.9%。食管癌癌组织p16基因的甲基化率显著高于癌旁组织和正常人群对照组,差异有统计学意义(P<0.05),p16基因启动子区甲基化与肿瘤分化程度密切相关。结论新疆哈萨克族、汉族食管癌患者中p16基因启动子甲基化与食管癌的发生有密切的关系。

实时荧光定量PCR检测膀胱癌TWIST1基因启动子的甲基化状态

目的建立针对TWIST1基因启动子甲基化状态的荧光定量检测方法,进而评估其在膀胱癌临床研究的应用前景。方法应用实时荧光定量PCR方法检测南通地区50例确诊膀胱癌患者和25例非膀胱癌的健康对照者的尿液标本中TWIST1基因启动子的甲基化和非甲基化含量,对其甲基化率进行对比。结果正常人的TWIST1启动子的甲基化率为8.1%～17.3%,平均值为12.3%,膀胱癌患者的甲基化率为25.2%～48.3%,平均值为38.2%,膀胱癌患者的TWIST1基因启动子甲基化率有明显的增高(P<0.05)。结论 TWIST1基因启动子区在膀胱癌中异常甲基化,能够作为有效检测膀胱癌的基因。

肝细胞癌和慢性肝病组织中p27^(kip1)基因表达及甲基化分析

目的研究肝细胞癌和慢性肝病中细胞周期调控因子p27kip1的表达和甲基化的关系.方法应用免疫组织化学、原位分子杂交技术分别检测正常肝组织、肝硬化、癌周肝硬化和肝细胞癌共68例标本中P27蛋白和p27mRNA的表达.应用甲基化特异性PCR技术检测正常肝组织、肝硬化和肝细胞癌共44例标本中p27基因甲基化情况.结果P27蛋白阳性率在正常肝组织(66.7%,4/6)、肝硬化(60.0%,6/10)和癌周肝硬化(50.0%,12/24)各组间差异没有统计学意义(P>0.05),p27mRNA阳性率在正常肝组织(83.3%,5/6)、肝硬化(70.0%,7/10)和癌周肝硬化(75.0%,18/24)各组间差异也没有统计学意义(P>0.05),但肝细胞癌组P27蛋白(21.4%,6/28)和mRNA(25.0%,7/28)的阳性率与各组比较均显著下降(P<0.05).P27蛋白阳性信号在正常肝组织和肝硬化组主要定位于胞核,而癌周肝硬化组和肝细胞癌组主要定位于胞浆.正常组与肝硬化合并组P27蛋白和p27mRNA表达具有相关性,癌周肝硬化组和肝细胞癌组P27蛋白与p27mRNA表达不具有相关性.44例样本中检出1例肝细胞癌的p27基因发生甲基化,其蛋白和mRNA表达均呈阴性.结论P27蛋白及p27mRNA表达下降或缺失可能参与了肝细胞癌的发生和发展,p27基因甲基化可能导致p27mRNA的失转录.

胃癌中ABCG2的表达及其甲基化探讨

目的观察胃癌中三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP binding cassette transpoter G2,ABCG2)基因的表达及其启动子区CpG岛甲基化水平,探讨其在胃癌发生、发展中的作用。方法采用实时荧光定量RT-PCR法检测6株胃癌细胞株和76例胃癌组织标本及其对应的癌旁组织中ABCG2 mRNA表达,应用免疫组化SP法检测ABCG2蛋白表达。应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测ABCG2基因启动子区的甲基化状态。结果 (1)实时荧光定量RT-PCR结果显示ABCG2在低分化胃癌细胞系HGC-27、MKN-45中呈高表达,而在高分化胃癌细胞系AGS及低分化胃癌细胞系MGC-803中呈低表达。胃癌组织中ABCG2 mRNA的表达下调,与患者性别、年龄、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移无明显相关,但与胃癌分化程度相关。(2)免疫组化结果显示胃癌组织中ABCG2阳性率为41%,癌旁组织中ABCG2阳性率为35%,两组间差异无统计学意义。有淋巴结转移与无淋巴结转移的胃癌组织中ABCG2阳性率分别为54.5%、21.8%,差异有统计学意义。低分化腺癌与高+中分化腺癌组织中ABCG2阳性率分别为62.5%、16.7%,差异有统计学意义。(3)甲基化结果显示仅在胃癌细胞系MGC-803检测到ABCG2基因甲基化,胃癌组织中未检测到甲基化。结论 ABCG2的表达与胃癌的分化程度及侵袭能力有关,其甲基化不参与胃癌的发生、发展。

胶质瘤组织中DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化研究

背景与目的:O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase,MGMT)是肿瘤细胞产生亚硝脲药物抗药性的分子基础。启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活,影响MGMT蛋白表达。本研究探索了胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态及其与MGMT蛋白表达的关系。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应分析胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态,同时采用免疫组织化学法分析胶质瘤组织中MGMT蛋白表达情况。结果:在27例胶质瘤患者的肿瘤组织标本中,18例MGMT蛋白表达呈阳性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为38.9%;9例MGMT蛋白表达呈阴性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为77.8%(P<0.05)。结论:MGMT基因启动子区的甲基化状态与MGMT蛋白的表达相关。MGMT基因启动子过甲基化,MGMT蛋白表达较低;MGMT基因启动子去甲基化,MGMT蛋白表达较高。

灯盏花自交不亲和SRK基因编码区甲基化分析

为研究灯盏花自交不亲和基因SRK(Eb SRK)的DNA甲基化变异,本文利用甲基化敏感限制性内切酶-PCR法,对Eb SRK基因中包含CCGG位点的部分编码区进行甲基化分析,同时,利用RT-PCR检测Eb SRK基因在灯盏花不同组织中的表达情况。实验结果显示,Eb SRK基因中的两个CCGG位点不存在甲基化,而Eb SRK基因在不同组织该基因的表达量有显著的差异性。这说明对Eb SRK等位基因的抑制不是由于Eb SRK基因中CCGG位点甲基化引起,而存在其他的调控机理。

玉米MuDR转座子DNA甲基化的MSP检测(英文)

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于高等动植物中,并在维持基因组稳定性、调节基因表达等方面起着重要作用,因此建立快速有效地DNA甲基化检测技术至关重要。本文以两种不同MuDR活性的玉米转座子材料为研究对象,探讨了甲基化特异性PCR(MSP)在检测DNA甲基化的有效性。结果表明:MSP技术可快速有效地检测MuDR转座子的末端反向重复(TIRs)序列内的CpG岛DNA甲基化的变化,灵敏度高,特异性强,可作为植物已知基因DNA甲基化检测的一种新方法。同时利用MSP研究发现,玉米MuDR转座子的活性随其TIRs序列内的CpG岛DNA甲基化的变化而改变,DNA甲基化是调控玉米MuDR转座活性的重要分子机制之一。

新疆哈萨克族食管癌患者金属硫蛋白3CpG岛甲基化的研究

目的探讨分析新疆哈萨克族食管癌患者食管癌组织及癌旁组织中金属硫蛋白3(metallothionein-3,MT-3)基因CpG岛的甲基化状态及其与食管癌发生的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)的方法,检测33例哈萨克族食管癌患者食管癌组织和癌旁组织中金属硫蛋白3(MT-3)基因启动子区CpG岛的甲基化发生状况。结果 33例哈萨克族食管癌患者癌组织和癌旁组织标本中MT-3基因启动子区CpG岛甲基化的发生率分别为66.7%(22/33)和27.3%(9/33);癌组织与癌旁组织甲基化率差异有统计学意义(χ2=10.28,P=0.001)。结论 MT-3基因的甲基化可能与食管癌的发生与发展有关。

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。