嗜吞噬细胞无浆体MSP4蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】利用原核表达系统表达嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum,AP)MSP4蛋白,并制备抗MSP4蛋白的多克隆抗体,为嗜吞噬细胞无浆体检测方法的建立提供试验材料和理论依据。【方法】根据GenBank公布的MSP 4基因优化并合成MSP 4基因,将其插入pET-30a载体,构建pET-30a-MSP4重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,对影响表达效果的因素(温度和IPTG)进行优化,选择最佳诱导表达条件,经SDS-PAGE分析蛋白表达情况,重组蛋白经Ni-IDA亲和层析纯化,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后的重组蛋白MSP4免疫新西兰大白兔制备兔源多克隆抗体,利用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及特异性。【结果】本研究成功构建pET-30a-MSP4重组质粒,在37℃、0.8 mmol/L IPTG诱导条件下蛋白表达量较高,表达的重组蛋白分子质量约为28 ku,以包涵体形式存在。Western blotting鉴定结果显示,其免疫原性较好。获得的多克隆抗体效价分别为1∶64000(家兔1)和1∶128000(家兔2),且能与表达的重组蛋白MSP4发生特异性反应,具有较好的免疫原性。【结论】本研究成功表达纯化了嗜吞噬细胞无浆体MSP4蛋白,并制备了其多克隆抗体,可为嗜吞噬细胞无浆体抗原抗体检测方法的建立及疫苗效果评估提供参考,也为MSP4蛋白功能研究奠定基础。

嗜吞噬细胞无形体msp4蛋白的生物信息学分析及表达鉴定

分析预测嗜吞噬细胞无形体msp4蛋白的抗原性,对嗜吞噬细胞无形体的msp4蛋白采用生物信息学对其进行分析二级结构,亲水性,疏水性,B细胞线性表位;根据分析的优势抗原表位区,进行基因合成并亚克隆至p ET32a表达载体,在大肠埃希菌中获得重组蛋白。生物信息学分析结果显示msp4蛋白由283个氨基酸组成,分子量为29.8 ku,理论等电点为6.05,不稳定系数为32.79,总平均疏水性为0.063;二级结构预测msp4蛋白主要以无规卷曲、延伸链、α-螺旋为主;B细胞表位预测msp4蛋白有14个线性表位;根据分析的结果选取msp4蛋白亲水性高的膜外区的28-158位序列克隆至p ET32a进行原核表达,在34 ku出有目的蛋白的表达。成功对嗜吞噬细胞无形体的msp4蛋白原核表达及纯化,为无形体病血清学检测方法的建立奠定了物质基础。

湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明边缘无浆体(A.marginale)MSP4基因的遗传变异情况。应用PCR扩增A.marginale虫株的MSP4基因的部分序列(pMSP4),将其克隆至pGEM-T载体,重组质粒经菌落PCR鉴定及序列分析,结果表明来自湖南省的6株边缘pMSP4的序列长度均为530bp,与GenBank中登录的A.marginale相应序列相似性在98.3%以上,与其它无浆体的差异大于9.7%。由于A.marginale pMSP4序列种内相对保守,种间差异较大,因此,可作为种间遗传变异研究的标记。本研究为A.marginale的分子流行病学调查等提供了实验依据。

嗜吞噬细胞无形体ZJ-msp4基因的生物信息学分析

为了利用生物信息学预测嗜吞噬细胞无形体ZJ-msp4蛋白的优势抗原表位,给寻找无形体病诊断和预防的候选抗原表位提供参考,试验参照Gen Bank中的msp4基因序列(登录号为EU008082.1)进行生物信息学分析。结果表明:ZJ-msp4蛋白的分子质量为30.1 ku,理论等电点为5.71,该蛋白的不稳定系数为29.13,组成较多的氨基酸有丝氨酸(Ser,13.8%)、甘氨酸(Gly,9.2%)、丙氨酸(Ala,8.9%)等;二级结构预测ZJ-msp4蛋白主要以无规卷曲、延伸链、α螺旋为主,TMHMM2.0预测该蛋白的第7~29位氨基酸可能为跨膜区,该跨膜区可能为信号肽序列;Signal P 4.1预测在msp4蛋白的N端第1~29位氨基酸序列为信号肽序列,该分析结果与TMHMM2.0分析结果一致;B细胞表位预测该msp4蛋白有11个线性表位,其中以28~38位、64~77位、87~101位、134~143位、245~264位是ZJ-msp4蛋白的优势抗原表位区段,可以作为诊断无形体病的候选表位。

山羊无浆体MSP4全长基因的克隆测序与B细胞抗原表位预测

该试验对重庆忠县感染山羊的无浆体主要表面蛋白4(MSP4)基因进行克隆测序,并对其系统进化、基因型以及推导蛋白的B细胞抗原表位进行分析.结果表明:所克隆的MSP4基因片段大小为870bp,CDS序列全长852bp,编码283个氨基酸,GenBank登录号为HQ840746.该序列与已公布的羊无浆体MSP4(AY702923,HQ456347,HQ661165)同源性最高,均达99.8%.系统发育分析发现,该序列被聚类到羊无浆体群.抗原表位预测表明忠县山羊无浆体MSP4蛋白的优势B细胞抗原表位在N端第77-82(AGTALS),93-98(APSLSG),216-220(TAGLV)和244-249(GSTLAI)4个区段.本研究从分子水平证实重庆存在羊无浆体感染,我国羊无浆体至少有5个基因型,重庆山羊无浆体MSP4蛋白具有4个优势B细胞抗原表位,为羊无浆体病亚单位疫苗的研发提供了参考.

MSP430x4xx系列微控制器的独特时钟设计

MSP430x4xx系列微控制器采用了FLL +时钟设计 ,具有功耗极低以及处理能力强、运行速度快的特点。文中首先分析了系统的时钟与功耗之间的关系 ,然后重点介绍了MSP430x4xx系列FLL +的组成 ,同时分析了其工作原理 ,最后总结了FLL

基于MSP430F149的OLED显示系统的设计

有机发光二极管是最具发展潜力的显示技术之一,由于LCD具有价格偏高、可视角度小、反应时间慢等缺点,本文设计了基于MSP430F149的OLED显示系统电路。分析了OLED显示驱动芯片SSD1306的工作原理,采用美国德州仪器(TI)公司开发的MSP430F149作为处理器,显示模块采用ALINETEK的OLED12864,设计了SSD1306与MSP430F149的硬件接口连接,并分析了软件设计。

基于MSP430F149的频率计设计

设计了一种以超低功耗单片机MSP430F149为控制器,以高速的CPLD(复杂可编程逻辑器件)实现32位计数的频率计。在设计中应用单片机的数学运算和控制功能,实现了测量时间闸门的自动选择,频率和周期的统一处理。此外,利用MSP430F149内部的高速模拟比较器,实现了对正弦波小信号的预处理,使得该频率计能够在较宽的频率范围和幅度范围内进行测量。

基于MSP430单片机的弹道解算方法研究与实现

本文利用计算机软件设立了弹道模型,并且通过模型的建立研究分析了弹道解算的方法,并且对基于MSP430单片机的弹道解算在计算机的硬件和软件上都做出了相关调试工作,通过计算机与实物资料的结合验证,不论是在精度或者在实时性上,通过计算机设计出的弹道解算控制器均能满足其修正引信的要求。

山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL(HSP60)基因的克隆测序及分析

对疑似感染山羊的无浆体16SrRNA基因、主要表面蛋白4(MSP4)和编码HSP60的GroEL基因进行克隆测序及系统发育分析。发现所克隆的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列长度分别为1 464、870、977bp,GenBank登录号分别为JX898992、JX898990和JX898991。所获得的无浆体16SrRNA序列及GroEL序列与公布的羊无浆体南非OVI株(16SrRNA:AF414870;GroEL:AF441131)同源性最高,分别为98.8%和99.8%,而MSP4序列与重庆忠县羊无浆体ZX17株(HQ840746)同源性最高,达100%。系统发育分析显示,本试验获得的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列均被聚类到羊无浆体群。本试验首次同时克隆分析了山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL基因序列,从分子水平证实羊无浆体在重庆存在,建议在进行无浆体种类鉴定时,最好同时选择2个或2个以上物种鉴定基因进行克隆分析,以确保研究结果更可靠。

疟原虫裂殖子表面蛋白4和表面蛋白5

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白4(MSP4)和5(MSP5)及其在鼠疟原虫中的同源蛋白4/5(MSP4/5)为膜内在蛋白,其基因含2个外显子和1个内含子,编码分子量约36 kDa—40 kDa的蛋白。在蛋白的两端为疏水的信号肽区和GPI样区,近C端有一个EGF样结构区,含3对链内二硫键。恶性疟原虫不同株的MSP4之间可能存在散在的点突变,而MSP5则显示出极高的相似性。这些蛋白的免疫原性依赖于二硫键维系的空间构像。

利用套式PCR检测牛羊乏质体

为同时检测和鉴定牛边缘乏质体、中央乏质体及绵羊乏质体,根据这3种病原体的msp4基因核苷酸序列,自行设计、合成了针对3种乏质体的2对通用引物,及分别针对三者的特异引物,通过PCR条件优化,建立了检测乏质体及分别鉴定3种乏质体的套式PCR方法,并与OIE推荐的msp5半套式PCR比较。结果显示:该方法对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫、伊氏锥虫均未扩增出特异性片段。套式PCR检测乏质体DNA量为0.2pg(相当于6个感染红细胞)。检测1 119份来自6个不同地区的奶牛、肉牛、水牛及羊的临床样品,阳性106份,经鉴定边缘乏质体46份,中央乏质体15份,绵羊乏质体35份,混合感染中央乏质体和绵羊乏质体4份,混合感染边缘乏质体和绵羊乏质体3份,混合感染边缘乏质体和中央乏质体3份。首次在分子生物学水平证明中央乏质体存在于中国。同时,证明牛可以混合感染边缘乏质体和中央乏质体或绵羊乏质体,以及混合感染中央乏质体和绵羊乏质体。上述848份样品用OIE推荐的msp5半套式PCR同时检测,两者符合率为98.5%(835/848)。检测结果表明,msp4套式PCR特异、敏感,可用于边缘乏质体、中央乏质体、绵羊乏质体的检测和鉴定。

海南部分地区黄牛无浆体分子流行病学调查及遗传多样性分析

无浆体病(Anaplasmosis)是由几种无浆体(Anaplasma)经蜱媒传播的一种立克次氏体病。通过巢式PCR和常规PCR方法对海南地区4市县黄牛(N=176)进行无浆体分子流行病学调查。结果显示,黄牛无浆体感染率为14.8%,其中A.bovis、A.pagocytophilum和A.marginale感染率分别为11.4%、6.3%和5.7%,A.bovis在海南地区黄牛感染率最高,系统发育树分析显示A.bovis、A.marginale和A.pagocytophilum均无地理隔离分化特征,但A.pagocytophilum存在宿主特异性,通过A.pagocytophilum 16S rRNA/MSP4基因研究,可以进行溯源分析,了解海南地区无浆体病原是否存在宿主分化及地理分化特征,从而为该病防治提供有利支持。

新疆南部地区绵羊无形体流行情况调查

试验旨在确定新疆南部地区绵羊中绵羊无形体基因型种类,共采集240份绵羊血液样本,其中成羊和羔羊各120份样本。样本进行DNA提取,并应用绵羊无形体msp4基因种特异性引物对总DNA进行PCR扩增。测序结果应用DNAstar软件进行核苷酸序列和氨基酸序列比对,并应用MEGA 7.0构建系统进化树。结果显示,绵羊无形体在绵羊中总检出率为22.5%(54/240),其中成年雌性绵羊和羔羊无形体的检出率分别为37.5%(45/120)和7.5%(9/120)。所得序列经比对发现,其同源性为99.7%~100.0%,存在多个核苷酸位点发生改变,并获得3种基因型,分别为基因型Ⅱ型、Ⅲ型、GB3型,各基因型在绵羊中总流行率为5.4%(13/240)、15.0%(36/240)、2.1%(5/240)。研究表明,我国新疆南部地区绵羊中存在3种绵羊无形体基因型,其中基因Ⅲ型是新疆南部地区绵羊中普遍存在的基因型。

采用ZigBee技术的无线环境监测装置简介

在科技飞速发展的今天，环境监测已经逐渐向现代化、自动化、科技化、科学化等发展，在农业、工业环境方面就显得尤为重要，特别是环境监测方面。这些信息我们怎样来获得，这个问题需要我们用科学的力量来解决，也正因如此，本课题就应运而生了。本系统采用MSP430F149单片机为主控制器。设计的主要思路是通过传感器节点检测环境温度、光照的变化，以及有害气体的浓度，并将采集的数据传输给单片机进行初步处理，通过无线网关将数据发回中心节点，并在中心节点上显示分析采集到的环境信息。

中国西南横断山区小型兽类嗜吞噬细胞无形体基因的检测及序列测定

目的了解中国西南横断山区小型兽类自然感染嗜吞噬细胞无形体的情况。方法采集位于滇西北横断山区的高黎贡山山脉、香格里拉雪山等山地（海拔1000～4500m）林区的小型兽类脏器标本以低温保存和运输，所获标本在实验室应用聚合酶链反应（PCR）方法对嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因和Msp4基因片段进行扩增测序，并将所测序列与GenBank中注册的基因序列进行相似性比较。结果共检测小型兽类5目18属35种共436只，从6属11种小型兽类中发现阳性标本32份，总阳性率为7．34％。其中，高黎贡山林区检测小型兽类标本25种301只，阳性26份，阳性率为8．64％（26／301）；香格里拉雪山等林区检测小型兽类标本19种135只，阳性6份，阳性率为4．44％（6／135）；阳性标本绝大部分发现于小型兽类中的啮齿类动物。序列比较分析表明：不同小型兽类间的16SrRNA基因序列相似性为99％-100％，且与吉林野鼠中检测的无形体相对应片段（GenBank：DQ449948）最相近，相似性达99％-100％。对其Msp4基因核苷酸序列进一步分析发现与GenBank中相应片段相似性为95％-97％，提示中国西南横断山区小型兽类所感染无形体株变异较大。结论首次证实和发现中国西南横断山区6属11种小型兽类自然感染嗜吞噬细胞无形体，其中啮齿类动物可能是这一地区嗜吞噬细胞无形体的主要宿主。

边缘无浆体SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中边缘无浆体的MSP4基因序列(EU677383)设计2对引物(AmspF3/R3和Am-spF4/R4)并克隆MSP4部分基因,构建含有MSP4基因的标准质粒,以AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了边缘无浆体的MSP4SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用于临床血样检测。结果显示,该方法可以检测到1×102 copies/μL的标准质粒DNA,该方法对绵羊无浆体、附红细胞体、东方巴贝斯虫、组织滴虫提取的DNA均为阴性反应。结果表明,该方法与常规PCR方法比较,阳性及阴性符合率都为100%,且具有敏感、重复性好、无污染特性,并具有能准确定量的特点,说明该方法具有很好的应用前景和研究价值。

基于无线通信的脉搏信号采集系统

应用无线通信技术的脉搏信号采集系统减少了系统各部分间的电缆连接。分别以MSP430F2234系统级芯片和AT89S52单片机为主控芯片,nRF905无线数据传输芯片为核心,围绕计算机设计了一种无线脉搏信号采集系统,从系统的组成结构出发,分析了各个模块的基本功能及如何实现,给出了硬件和软件设计。该系统实现了人体脉搏信号的短程无线测量,具有体积小、重量轻、成本低、携带方便、应用价值高等优点,在实时医疗监护中具有重要的意义。