MTS_1基因β启动子E_2F_1结合位点序列突变重组质粒的构建与表达

目的 :深入研究MTS1 基因 β 启动子的转录激活与E2F1 转录因子的相互作用关系 ,阐明该基因转录水平的调控机制。方法 :用PCR定点突变方法或酶切连接法 ,构建β 启动子0.38kbSacⅡ -SacⅠ酶切片段中E2F1 A、B、C任意2个位点或3个位点均突变的 pGL3 重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法 ,将构建的重组质粒转染MTS1 基因双等位缺失的急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞 ,检测pGL3 重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。 结果 :构建的E2F1 A、B、C结合位点突变的重组质粒经SacⅠ或NaeⅠ酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2F1 位点野生型重组质粒比较 ,突变型重组质粒在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少 ,以3个位点均突变的重组质粒为明显。 结论 :构建的E2F1 A、B、C2个或3个结合位点均突变重组质粒成功 ,可通过基因转染用于研究MTS1 基因的功能试验中 ;MTS1 基因β 启动子的转录活性可能与E2F1 转录因子的反式激活有关。

花生2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因VTE3的克隆及多态性分析

【目的】分离花生2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因VTE3,揭示其分子生物学特征及遗传多态性。【方法】利用EST拼接、RT-PCR以及以DNA为模板的PCR扩增技术,从花生属栽培种中分离VTE3全长cDNA;从不同类型栽培品种和花生属花生区组二倍体野生种(Arachis duranensis和A.ipaensis)中分离VTE3全长DNA,进行VTE3序列多态性分析,并构建VTE3的进化树。【结果】从3个栽培品种中分别克隆得到2条VTE3 cDNA序列(命名为rVTE3-1和rVTE3-2),rVTE3-1和rVTE3-2的编码区长均为1 059 bp,二者同源性97.8%,存在10个变异位点,其中8个为SNP变异;二者均编码351个氨基酸,氨基酸序列同源性98.6%,存在5个氨基酸差异。从13个栽培品种分别克隆得到2条VTE3 DNA序列(命名为gVTE3-1和gVTE3-2),13个品种间gVTE3-1的同源性为99.9%,gVTE3-2的同源性为100%。其中丰花2号gVTE3-1序列长2 710 bp,存在3个内含子,分别位于44—163、772—1 295和1 603—2 437 bp处;gVTE3-2序列长2 706 bp,也存在3个内含子,分别位于44—169、778—1 291和1 599—2 433 bp处。丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6%,内含子区域存在36个SNP位点和3个限制性内切酶识别的多态性位点。从A.duranensis分离的VTE3 DNA序列命名为gVTE3-A,从A.ipaensis分离的VTE3 DNA序列命名为gVTE3-B。利用栽培种丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2以及野生种gVTE3-A和gVTE3-B 4条DNA序列进行进化分析,推测序列gVTE3-1和gVTE3-2分别来自丰花2号的A、B染色体组。花生MPBQMT氨基酸序列与其它物种的同源性较高,具有很强的保守性。【结论】本研究克隆了花生VTE3的全长cDNA和DNA;推断栽培品种的gVTE3-1和gVTE3-2分别来自A、B染色体组,不同染色体组的VTE3多态性位点丰富;不同栽培品种间等位基因核苷酸序列差异很小,所检测13个栽培品种的gVTE3-1以及野生种的gVTE3-A间存在等位变异,13个栽培品种的gVTE3-2以及野生种gVTE3-B间未发现等位变异。

参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究

目的揭示参环毛蚓MT-2基因的转录调控机制,为今后采用基因工程技术改良参环毛蚓重金属富集性状奠定基础。方法根据已知的MT-2c DNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增参环毛蚓MT-2基因的编码区基因组序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。结果经PCR扩增、测序后获得2 826 bp MT-2基因编码区序列,将该序列与已知MT-2 c DNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1 534 bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个特异响应重金属参与调控MT-2表达的MRE元件。结论参环毛蚓的MT-2基因能被重金属诱导表达,MT-2基因转录水平的金属调控是通过MT-2基因启动子区的金属调控元件MRE来实现的。

天祝白牦牛金属硫蛋白基因的克隆及表达

运用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛金属硫蛋白(MT-2)基因全长cDNA序列,对其生物学进行分析,并通过荧光定量PCR双标准曲线法和2-ΔΔct法建立检测MT-2基因表达的方法.结果表明:扩增获得的天祝白牦牛MT-2基因全长为410bp(GenBank登录号:KF888633),ORF长185bp,编码61个氨基酸.该基因无跨膜结构,为非分泌型蛋白.构建系统进化树结果显示,天祝白牦牛MT-2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性,与黄牛和羊的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,双标准曲线法特异性强、灵敏度高、稳定性好,对天祝白牦牛MT-2的定量检测具有重要意义.

镉对Ⅱ型糖尿病小鼠金属硫蛋白基因表达的诱导与镉肾脏毒性之关系

[目的 ]探讨金属硫蛋白基因诱导表达能力与Ⅱ型糖尿病小鼠 (ob/ob小鼠 )对镉金属硫蛋白肾脏毒性易感性之间的关系。 [方法 ]以 β actin为内参照 ,采用半定量RT PCR方法检测在相同肾皮质镉水平条件下 ,镉对ob/ob小鼠和瘦型小鼠 (正常小鼠 )肾皮质MT1和MT2基因的诱导表达。 [结果 ]镉对ob/ob小鼠肾皮质MT1和MT2基因诱导表达的能力过低 ,而镉对瘦型小鼠MT1及MT2基因具有明显的诱导能力。 [结论

家蚕马氏管免疫相关蛋白基因BmNOS的研究

借助蛋白双向电泳(2-D)技术对感染家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)不同时相的家蚕幼虫马氏管蛋白进行分离,并对其中14个差异蛋白点进行质谱分析.结果表明:10个蛋白点得到成功鉴定,其中的一个可信结果为家蚕一氧化氮合酶(Bombyx mori Nitric oxide synthase,BmNOS).由于诱导型BmNOS是合成巨噬细胞免疫效应因子NO的一种关键特异性蛋白酶,因此通过体内注射BmNPV和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)两种诱导剂,采用半定量和实时荧光定量PCR的方法,对感染组和对照组马氏管中BmNOS不同感染时期的表达进行了定量分析.结果表明:经两种诱导剂处理3 h后,BmNOS表达量均迅速递增,BmNPV侵染组上调约7倍;LPS处理组表达量上调25倍,且该趋势持续至6 h,随后逐渐降低并趋于平稳,这表明BmNOS在家蚕马氏管的免疫中具有重要的功能.

重复加热致肝癌HepG2细胞对化疗药耐受性与细胞凋亡的变化

目的探讨多次加热肝癌HepG2细胞后，残存细胞对化疗药耐受性与细胞凋亡变化的关系。方法HepG2细胞43℃加热，每次80min，每天2次，10个循环后，MTT法分析其对阿霉素的敏感性，试剂盒检测细胞的凋亡，免疫组化法检测细胞Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达，RT-PCR法检测细胞Bcl-2mRNA及BaxmRNA的表达，结果热处理后的HepG2细胞对阿霉素的化疗耐受性升高，细胞凋亡率减低，Bcl-2基因／蛋白的表达增强，Bcl-2／Bax值增大。结论热处理后HepG2细胞对化疗药物耐受性增高可能与其凋亡率降低、Bcl-2基因／蛋白的表达增强及Bcl-2／Bax值增大有关。