肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .

黏蛋白MUC1/Y在膀胱癌中的表达及其意义

目的:检测黏蛋白MUC1/Y在膀胱肿瘤病变中的表达,探讨其在膀胱肿瘤诊断和免疫治疗中的意义。方法:采用免疫组化S P法和高清晰度彩色医学图文分析系统,对48例膀胱肿瘤组织、45例腺性膀胱炎组织和10例正常膀胱组织(对照组)黏蛋白MUC1/Y的表达进行检测分析。结果:MUC1/Y仅在膀胱肿瘤中表达,且平均灰度均显著低于腺性膀胱炎组织和正常膀胱组织(P<0.001)。结论:MUC1/Y为一种新型的肿瘤标记物,它在膀胱肿瘤组织的高表达,为膀胱癌诊断和免疫治疗提供了理论依据。

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的:克隆人肿瘤MUC1/Y全长基因及构建真核表达载体 pEGFP MUC1/Y并观察 pEGFP MUC1/Y在 BIU 87细胞中表达以用于进一步生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法: 取新鲜膀胱肿瘤组织提取总RNA,采用随机引物进行反转录,将特异引物扩增的MUC1/Y全长 PCR产物克隆至真核表达载体 pEGFP C1,测序鉴定后命名为 pEGFP MUC1/Y,用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU 87,以 Western Blot检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1/Y全长cDNA编码序列, Western Blot检测和转染实验,表明构建的 pEGFP MUC1/Y基因在BIU 87真核细胞中表达,其绿色荧光蛋白瞬时表达率为 20%。结论:人肿瘤 MUC1/Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体 pEGFP MUC1/Y 构建成功,可用于肿瘤生物学治疗的研究。

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的:研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞(DC)的可行性,以及在体外诱导特异性抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。方法:以葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)作为载体,在多聚赖氨酸(PLL)的辅助下,通过静电作用结合MUC1/Y基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1/Y,在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显微镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MUC1/Y特异性抗膀胱癌(膀胱肿瘤BIU87细胞系)的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况;ELISA法测定基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力。结果:pEGFP-C1/-MUC1/Y转染效率为15%左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出显著的MUC1/Y特异性的CTL,对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52%,显著高于对照组T-DC诱导的CTL;在透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。

MUC1及同种型MUC1/Y基因mRNA在膀胱癌中的表达及临床意义

目的:探讨肿瘤相关抗原MUC1及同种型MUC1/Y粘蛋白基因在膀胱癌中mRNA的表达及其临床意义。方法:22例膀胱癌的组织样本(实验组)和10例正常膀胱组织样本(对照组)中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测两组样本中MUC1及同种型MUC1/Y粘蛋白基因mRNA表达水平。结果:膀胱癌组织的MUC1mRNA水平较正常膀胱组织显著增高(P<0.01);Ⅲ-Ⅳ期膀胱癌组织的MUC1/YmRNA水平较Ⅰ-Ⅱ期膀胱癌组织显著增高(P<0.01)。结论:MUC1及同种型MUC1/Y粘蛋白基因mRNA表达水平与膀胱癌有关,对膀胱癌的诊断和治疗有临床意义。

MUC1/Y基因体外冲击树突状细胞诱导抗瘤免疫反应

目的 :制备含MUC1 YcDNA质粒转染的树突状细胞 (DC) ,体外诱导杀伤细胞 ,研究其治疗消化道肿瘤的效果。方法 :构建MUC1 YcDNA真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1 Y、pcDNA3 1 MUC1 Y。以pcDNA3 1 MUC Y电转染 8例HLA A2 ( + )消化道肿瘤患者单个核细胞衍生的DC后 ,与自体T细胞混合培养 ,诱导CTL(T pcDAN3 1 MUC1 Y)。以SW6 2 0细胞 [HLA A2 ( + ) 、MUC1 Y( + ) ]为特异性靶细胞 ,Raji细胞 [HLA A2 ( - ) 、MUC1 Y( - ) ]和Lovo细胞 [HLA A2 ( - ) 、MUC1 Y( + ) ]为非特异性靶细胞 ,通过乳酸脱氢酶 (LDH)释放实验测定杀伤活性 ,ELISA法检测基因修饰后DC刺激自体T细胞产生IFN γ的能力 ,并以AN NEXINV FITC试剂盒检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡情况。结果 :pIRES2 EGFP MUC1 Y转染效率为 8%左右。T pcDAN3 1 MUC1 Y诱导的杀伤作用显著高于T pcDNA3 1[pcDNA3 1(+)修饰DC诱导的CTL]和T IL 2 (IL 2刺激外周血单个核细胞产生的CTL) ,P <0 0 5。而且T pcDNA3 1 MUC1 Y对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于对照组。基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平IFN γ ,与未转染的DC相比具有显著差异 (P <0 0 5 )。结论 :成功构建MUC1 Y全长cDNA真核表达载体。pIRES2 EGFP MUC1 Y可用于真核细胞转染 ,通过观察转?

MUC1/Y基因在胃肠道肿瘤中的表达及诱导抗肿瘤免疫

目的 研究MUC1/Y基因异常表达在消化道肿瘤中的临床意义 ;构建MUC1/YcDNA全长载体 ,修饰树突状细胞 (DC)诱导杀伤细胞治疗消化道肿瘤。方法 采用RT PCR方法检测标本中MUC1/YmRNA表达。选取 8例HLA A2 + 消化道肿瘤患者 ,体外诱导DC ,以构建的MUC1/YcDNA真核表达载体pcDNA3.1 MUC1/Y修饰DC诱导CTL。通过检测对靶细胞SW6 2 0和Raji的杀伤作用和诱导靶细胞凋亡的能力来评价抗肿瘤免疫反应。结果 93.88%肿瘤组织表达较高水平的MUC1/Y。分析表明 :消化道肿瘤中MUC1/YmRNA表达与组织学分型、肿瘤生长方式、浸润程度及TNM临床分期有关 ;与性别、肿瘤发生部位及分化程度无关。pcDNA3.1 MUC1/Y修饰DC诱导的CTL对特异性靶细胞的杀伤活性显著高于对照组 ,并能有效诱导靶细胞凋亡。结论 MUC1/YmRNA表达在消化道肿瘤组织具有重要意义 ;经pcDNA3.1

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的:克隆人肿瘤MUC1/Y全长基因及构建真核表达载体EGFP-MUC1/Y,并观察EGFP-MUC1/Y在BIU-87细胞中的表达,以进一步用于生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法:取新鲜膀胱肿瘤组织,提取总RNA,采用随机引物进行逆转录,将特异引物扩增的MUC1/Y全长PCR产物克隆至真核表达载体pEG-FP-C1,测序鉴定后命名为EGFP-MUC1/Y,用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU-87,以Western Blot检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1/Y全长cDNA编码序列,Western Blot检测和转染实验表明,构建的pEGFP-MUC1/Y基因在BIU-87真核细胞中表达,其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20%。结论:人肿瘤MUC1/Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体pEGFP-MUC1/Y构建成功,可用于肿瘤生物学治疗的研究。

粘蛋白MUC1及同种型MUC1/Y在膀胱癌与膀胱良性病变中的表达及其意义

目的:检测粘蛋白MUC1及其同种型MUC1/Y在膀胱癌和膀胱良性病变表达,探讨其在膀胱癌诊断和免疫治疗中的意义。方法:采用免疫组化SP法和高清晰度彩色医学图文分析系统,对48例膀胱癌组织、45例腺性膀胱炎组织和10例正常膀胱组织(对照组)粘蛋白MUC1及其同种型MUC1/Y的表达,进行检测分析。结果:MUC1在膀胱癌组织、腺性膀胱炎组织中的平均灰度均显著低于正常膀胱组织(P<0.001);MUC1/Y仅在膀胱癌中有表达。结论:MUC1、MUC1/Y作为一种新型的肿瘤标志物,它们在膀胱癌组织的高表达及分布特点,可为膀胱癌诊断和免疫治疗提供实验基础。

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的 :探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法 :以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白(MUC1/Yex)为靶分子 ,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库 ,ELISA鉴定阳性克隆 ,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氨基酸序列 ;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆与正常及肿瘤细胞的结合能力及特异性。结果 :通过 4轮筛选 ,共获得 3种MUC1/Yex的结合肽 ,分别为HHWHSRSQLSWF ,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP ,其中HXXHS表位可能在与MUC1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论 :筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性 ,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。

MUC1/Y胞外段在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:获得MUC1/Y胞外段重组蛋白,研究其生物学功能,为肿瘤治疗提供实验依据。方法:利用RT-PCR从MCF7细胞中获得MUC1/Y胞外段编码基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a中,并在BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达;以亲和层析法对MUC1/Y重组蛋白进行纯化;利用纯化的MUC1/Y蛋白免疫家兔制备MUC1/Y多克隆抗体,然后对乳腺癌组织进行组化染色。结果:在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了分子量为30000的Trx-MUC1/Y融合蛋白,经镍亲和层析一步纯化所获得的蛋白质纯度>90%,用Trx-MUC1/Y融合蛋白免疫家兔获得的抗血清对乳腺癌组织的初步组化检测证明MUC1/Y融合蛋白具有很好的生物学活性。结论:成功表达并纯化了具有生物学活性的MUC1/Y胞外段重组蛋白。

MUC1/Y基因疫苗治疗膀胱肿瘤的实验研究

目的探讨人黏蛋白MUC1/Y基因DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlym-phocytes,CTL)及体液免疫应答的作用,为人膀胱癌疫苗的应用提供基础实验研究资料。方法通过pEGFP-C3-MUC1/Y质粒免疫雄性BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠抗体生成情况和CTL分泌IL-2和IFN-γ的量,并用LDH释放法测定CTL对膀胱癌细胞株BIU-87的特异性杀伤率。结果在接种疫苗的小鼠体内特异性抗体明显升高,CTL分泌的IL-2和IFN-γ较对照组高。在效靶比为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1时,实验组特异性CTL对BIU-87杀伤率分别为50.9%、45.9%、47.5%和18.6%,而对照组(空载体pEGFP-C3和灭菌生理盐水)分别为18.3%、10.7%、13.8%、6.3%;16.5%、11.9%、8.6%和10.3%。实验组与对照组两者之间差异具有显著性(P<0.01)。结论MUC1/YDNA疫苗能够诱导小鼠体内产生抗人膀胱癌黏蛋白的特异性抗体,并能诱导产生特异杀伤表达MUC1/Y的靶细胞的CTL,为MUC1/Y基因疫苗用于膀胱肿瘤生物免疫提供一种新的治疗策略。

MUC1/Y特异表位肽在大肠杆菌中的可溶性表达及其抗体的制备

为获得MUC1 Y的特异表位肽 ,制备抗体 ,用PCR扩增其编码序列 ,克隆到pGEX 2T中 ,转化DH5α感受态 ,0 2mmol LIPTG诱导表达 ,超声破碎或B PERTMⅡ试剂处理诱导菌 ,亲和层析和阴离子交换纯化目的蛋白 ,SDS PAGE及Westernblotting鉴定 ;免疫家兔制备多抗 ,初步用于免疫组化分析。结果表明 ,转化菌经诱导后表达融合蛋白GST Y30 ,约占菌体总蛋白的 2 0 % ,大多以可溶形式存在 ,与诱导温度无关。免疫家兔获得多抗 ,效价为1∶32 0 0 0 0 ,纯化的抗体具有特异性 ,可识别肿瘤细胞表面的MUC1 Y蛋白。所得蛋白和抗体可用于MUC1 Y的表达特征及其生物学功能研究。

MUC1/Y基因修饰的树突状细胞体外抗卵巢癌效应的研究

目的研究人MUC1/Y基因转染人外周血树突状细胞(DC)后在体外诱导的特异性抗MUC1/Y+卵巢癌效应。方法通过人外周血单核细胞诱导DC,采用脂质体法将已构建好的含人MUC1/Y全长cDNA的真核表达载体pEGFPN1/MUC1/Y转染到DC中,荧光显微镜下观察其表达的蛋白定位;与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MUC1/Y+的卵巢癌细胞A2780的杀伤活性,并与转染空载体的DC诱导的CTL进行比较。结果pEGFPN1/MUC1/Y转染DC后,其绿色荧光蛋白主要表达于DC细胞膜上,可诱导出对卵巢癌细胞系A2780特异性的细胞毒性T细胞。结论MUC1/Y基因修饰的DC可诱导特异的抗MUC1/Y+卵巢癌效应。

MUC1/Y基因真核表达载体构建及MUC1、MUC1/Y体外修饰DC诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的 构建MUC1 Y全长cDNA真核表达载体 ,并以MUC1及MUC1 Y真核表达载体修饰树突状细胞 (DC)诱导特异性抗肿瘤免疫。方法 构建MUC1 YDNA真核表达载体 ,选取 10例HLA A2乳腺癌患者 ,体外IL 4、GM CSF联合诱导DC ,并以pCDNA3.1 MUC1和pCDNA3.1 MUC1 Y转染DC ,同时以空载体为对照 ,以pIRES2 EGFP MUC1 Y观察转染效率 ,转染后DC与自体T细胞混合培养 ,诱导CTL。以MCF 7为特异性靶细胞 ,Raji为非特异性靶细胞 ,通过乳酸脱氢酶释放实验检测杀伤活性 ,以annexinⅤ FITC检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡的情况。以ELISA法测定基因修饰后DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力。结果 酶切鉴定及测序结果表明成功构建了MUC1 Y真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1 Y和pCDNA3.1 MUC1 Y。pIRES2 EGFP MUC1 Y转染效率基本为 10 %左右 ,DC中MUC1表达率为 8%。杀伤实验表明T DC pCDNA3.1 MUC的杀伤活性为 6 4 % ,T DC pCDNA3.1 MUC1 Y为 4 6 %。这两组间差异有显著性 ,同时与对照组比较差异均有显著性。annexinⅤ FITC标记实验显示 ,T DC pCDNA3.1 MUC1对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于T DC pCDNA3.1 MUC1 Y及对照组。基因修饰DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力显著升高。结论 构建的真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1

肿瘤相关粘蛋白MUC1及其同种型MUC1/Y与卵巢上皮性肿瘤关系的研究

目的 探讨肿瘤相关粘蛋白MUC1及其同种型MUC1 /Y粘蛋白在卵巢上皮性肿瘤的变化特征。方法 采用免疫组化ABC法 ,对 72例卵巢上皮性、浆液性和粘液性肿瘤组织和 8例正常卵巢组织MUC1和MUC1 /Y粘蛋白进行检测。结果 MUC1在卵巢癌中的表达率 ( 80 % )高于良性上皮性肿瘤 ( 4 5 % )和正常卵巢组织 ( 37 5 % ) ,P <0 0 0 5。MUC1 /Y仅在卵巢癌中表达 ,二者高表达 ,与卵巢癌的恶性程度高、组织分化差、癌瘤播散及淋巴结转移有关。结论 MUC1、MUC1 /Y作为一种新型的肿瘤标志物 ,与卵巢癌的发生、发展密切相关。