MAD2蛋白在人正常组织和胃癌组织中的表达

目的:研究MAD2蛋白在人正常组织和胃癌中的表达及其临床意义。方法:用免疫组织化学方法检测23例人正常组织及102例胃癌及癌旁组织中MAD2蛋白的表达。结果:MAD2蛋白在23例正常组织中主要定位在胞核和胞浆中,在正常胃组织主要定位在胞浆,在胃癌组织中主要定位在胞核和胞浆。MAD2在胃癌中和癌旁组织的表达阳性率分别为70.59%(72/102)和38.24%(39/102),两者差异具有统计学意义(P<0.001)。MAD2蛋白表达与肿瘤组织分化程度呈负相关,与淋巴结转移呈正相关(P<0.001)。结论:MAD2蛋白在细胞有丝分裂监测点中发挥重要作用,其亚细胞定位在胃癌形成中发生变化,MAD2表达在胃癌发生过程中具有重要作用,对其检测有助于胃癌恶性程度评价和预后判断。

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。

人Mad2基因正义真核表达质粒的构建及其对人卵巢癌细胞A2780紫杉醇敏感性的影响

背景与目的:紫杉醇是一种高效广谱的抗肿瘤药物,已常规应用于卵巢癌的化疗。但近年来随着耐药的发生,紫杉醇耐药已成为影响肿瘤化疗预后的主要难题,有研究显示紫杉醇药效的发挥与纺锤体检测点功能完整性相关。本研究通过构建人纺锤体检测点蛋白Mad2基因正义真核表达质粒,旨在探讨Mad2蛋白对人卵巢癌A2780细胞株紫杉醇敏感性的影响。方法:构建pEGFP-Mad2正义表达质粒,通过脂质体LipofectamineTM 2000将其转入体外培养的人卵巢癌细胞株A2780中,应用RT-PCR、Western blot等方法分析相关基因和蛋白水平的变化情况;通过流式细胞术比较稳筛细胞对紫杉醇敏感性的改变情况。结果:成功构建了pEGFP-Mad2正义表达质粒;并筛选出稳定高表达Mad2的细胞株。RT-PCR、Western blot检测均显示稳定筛出的pEGFP-Mad2/A2780细胞株中Mad2呈高表达。流式细胞术检测结果显示,紫杉醇作用24或48 h后,对照组pEGFP-N1/A2780的细胞凋亡率分别为12.34%和58.76%,而pEGFP-Mad2/A2780组细胞凋亡率则分别为27.32%和87.53%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:pEGFP-Mad2正义表达质粒能够有效上调A2780细胞中Mad2基因mRNA和蛋白的表达,并增加人卵巢癌细胞A2780对紫杉醇化疗的敏感性。

MAD2基因沉默促进人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的实验研究

背景与目的:有丝分裂检测点缺陷可引起细胞染色体不稳定性而使细胞生物学行为改变,本实验探讨RNA干扰有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient2,MAD2)基因表达对人食管鳞癌细胞系KYSE30细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:利用脂质体转染的方法,将MAD2基因的siRNA转染食管鳞癌细胞KYSE30,并通过RT-PCR以及免疫印迹的方法进行siRNA效果鉴定。实验分为正常对照组、非特异干扰组、特异干扰组。MTT、克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,损伤刮擦实验和Transwell小室实验分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力。结果:siRNA作用48h组,MAD2蛋白的表达最低;相应地,迁移黏附能力增强,侵袭实验显示转染后细胞侵袭能力较转染前有显著加强。结论:MAD2基因沉默能够促进人食管鳞癌细胞系KYSE30的体外增殖和侵袭能力增强,并抑制凋亡,提示其变化对肿瘤的发生和转移发挥重要作用。

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的:构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达。方法:通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列。将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒。应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光。结果:成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系。

微小RNA抑制胚胎细胞MAD2基因的表达

目的:探讨微小RNA(microRNA)抑制胚胎细胞MAD2基因表达的机理。方法:用定量real-time PCR比较microRNA转染前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时用western blot比较转染前后Mad2蛋白的表达水平。结果:对照组的MAD2基因mRNA拷贝数/GAPAH mRNA拷贝数为0.1780±0.0688,而转染microRNA重组质粒后,实验组的mRNA比值分别为0.1778±0.0689和0.1778±0.0670,经统计分析,两实验组细胞的内源性MAD2基因mRNA水平与对照组无显著性差异;而其中一实验组的蛋白水平在转染后有明显降低。结论:microRNA主要在翻译水平调节哺乳动物细胞内基因的表达,为研究基因表达的调控机制奠定了良好的基础。

绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)mad2敲除突变株(Δmad2),探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除盒S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株。通过对比敲除株与野生株(WT)的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12 h和14 h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8%和76.3%;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。敲除株处理花生12 h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因(CaM、CCaMK和DELLA)、脂质氮素转运相关基因(LTP1、NRT24、ABCC2)的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NRT24的转录无明显影响。【结论】金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录。

结直肠癌中MAD2和抑癌基因的表达及意义

背景与目的:有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient protein2,MAD2)是一种有丝分裂检查点成分,其与肿瘤的发生密切相关。本研究旨在了解结直肠癌中MAD2和抑癌基因表达概况,探寻在结直肠癌、腺瘤及正常结直肠黏膜组织中的表达差异,初步分析其临床意义。方法:通过实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative polymerase chain reaction,RFQ-PCR)和免疫组织化学方法检测结直肠癌、腺瘤及正常结直肠黏膜组织中MAD2表达,并对结直肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。同时利用免疫组织化学方法检测结直肠癌中p53、p27、p21和p16蛋白的表达。结果:结直肠癌组织中MAD2的阳性表达明显高于腺瘤和正常结直肠黏膜组织(66.7%vs39.6%vs22.9%),三者比较差异有统计学意义(P<0.001)。MAD2表达与肿瘤分化和无瘤生存时间有关(P<0.05)。结直肠癌组织中未见MAD2基因突变。MAD2阳性表达与p53、p27、p21和p16阳性表达之间有统计学意义(P<0.05)。结论:基因MAD2和抑癌基因表达异常与结直肠癌产的发生发展有关,MAD2可能是结直肠癌预后的一种重要预测指标。

MAD2和p16在大肠癌中的表达及意义

目的了解大肠癌中MAD2和p16的表达,探寻在大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中的表达差异,初步分析其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。同时利用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p16的表达。结果大肠癌组织中MAD2的阳性表达明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7%vs.39.6%vs.22.9%),三者比较差异有统计学意义(P<0.001)。MAD2表达与肿瘤分化和无瘤生存时间有关(P<0.05)。大肠癌组织中未见MAD2基因突变。正常大肠黏膜组织中p16阳性表达率为16.7%,大肠癌中阳性表达率为47.9%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论基因MAD2和p16表达异常是大肠癌产生的机制之一,与大肠癌的发生及发展有关。MAD2可能是大肠癌预后的一种重要预测指标。

沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响

目的:研究沉默MAD2基因对结肠癌细胞的影响。方法 :采用RT-PCR和Western印迹法筛选MAD2基因在7种结肠癌细胞中的高表达细胞株,并用siRNA瞬时转染以降低MAD2表达,随后采用CCK-8法检测结肠癌细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,transwell实验评估转染后结肠癌细胞迁移能力的改变。结果:SW1116细胞在mRNA和蛋白水平均呈现高表达MAD2,转染靶向MAD2的siRNA可显著降低MAD2在SW1116细胞中的表达。下调MAD2后,SW1116细胞的增殖能力较对照组有明显下降(P<0.05)。干扰siRNA组细胞凋亡比例较对照组增加,而细胞周期未见统计学差异。transwell实验中,siRNA干扰组穿膜细胞数为(45±2)个,显著低于阴性对照组[(185±5)个]和空白对照组[(195±5)个](P<0.01)。结论:SW1116高表达MAD2基因,沉默MAD2基因显著降低肠癌细胞增殖,诱导凋亡,并抑制细胞迁移。MAD2基因很可能成为新的预防结肠癌转移的目的基因。

MAD2和p27在大肠癌组织中的表达及意义

目的探讨MAD2和p27表达与大肠癌发生、发展的关系。方法采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法,检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。同时应用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p27表达情况。结果大肠癌组织中MAD2阳性表达率明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7%vs39.6%vs22.9%),三者间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。MAD2表达与大肠癌肿瘤分化和患者无瘤生存时间有关(P<0.05)。大肠癌组织中未见MAD2基因突变。正常大肠黏膜组织中p27阳性表达率为81.3%,大肠癌中其阳性表达率为41.7%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论MAD2和p27基因表达与大肠癌的发生及发展有关。MAD2可能是大肠癌预后的1个重要指标。

大肠癌中MAD2的表达及意义

目的了解大肠癌中MAD2表达情况,探讨其在大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中的表达差异,分析其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR和免疫组化方法检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。结果免疫组化方法结果显示大肠癌组织中MAD2的阳性表达明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7%vs39.6%vs22.9%),三者比较差异有统计学意义(P<0.001)。MAD2表达与肿瘤分化和无瘤生存时间有关(P<0.05)。实时荧光定量PCR提示肠癌组织中MAD2的表达量明显高于正常大肠黏膜组织,大肠癌组织中未见MAD2基因突变。结论基因MAD2表达异常是大肠癌产生的机制之一,与大肠癌的发生、发展有关,MAD2可能是大肠癌预后的一项重要预测指标。

EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。

双泛素与肿瘤关系的研究进展

双泛素属于泛素相关蛋白,由两个泛素样部分前后融合而成,是p53基因的一个下游靶点,与人纺锤体聚集检测点蛋白(MAD2)非共价结合导致染色体不稳定,与许多肿瘤的发生密切相关。以下仅就双泛素的结构、分子生物学功能及其与p53基因、MAD2蛋白和肿瘤发生的关系作一综述,为肿瘤的发生及治疗开辟新的思路。

大肠癌组织MAD2和p53表达及其临床意义的探讨

目的:了解大肠癌组织中MAD2和p53表达概况,探寻其表达差异及临床意义。方法:通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。同时利用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p53的表达。结果:大肠癌组织中MAD2的阳性表达明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织,三者比较差异有统计学意义,P<0.001。MAD2表达与分化程度和生存时间有关,P<0.05。大肠癌组织中未见MAD2基因突变。正常大肠黏膜组织中p53表达均为阴性,大肠癌组织中p53阳性表达率为50%。结论:MAD2和p53表达异常是大肠癌产生的机制之一,与大肠癌的发生、发展有关。