噬菌体展示技术筛选与白介素-32相互作用的蛋白

目的利用T7噬菌体展示技术筛选与白介素-32(interleukin-32,IL-32)相互作用的蛋白。方法构建IL-32α的原核表达重组质粒,表达并纯化重组IL-32α蛋白(recombinant IL-32α,rIL-32α);以纯化后的rIL-32α作为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选;对筛选到的阳性克隆进行DNA测序及计算机辅助分析;利用哺乳动物双杂交实验和免疫共沉淀实验对筛选到的阳性克隆进行验证。结果成功表达并亲和纯化了rIL-32α蛋白;经过5轮筛选,投入和产出的噬菌体滴度比值达到稳定;同源性分析初步确定9个与IL-32α蛋白相互作用的蛋白;进一步实验证实IL-32α与这9个蛋白片段能发生相互作用。结论利用T7噬菌体展示技术成功筛选到9个与IL-32α相互作用的蛋白,我们的发现为深入揭示IL-32的生物学功能奠定了研究基础。

ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。

HCBP1的细胞定位及与HCV核心蛋白在体内的相互作用

目的探讨HCV核心蛋白与(HCBP1)HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用。构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEMT载体,经测序正确后,分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平。将HCBP1的cDNA片段克隆入绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,转染COS-7细胞,以Western blot和荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其细胞定位。结果CAT-ELISA检测显示pM-核心蛋白与pVP16-HCBP1实验孔吸光度值高于其他阴性对照,但低于阳性对照组。成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,Western blot证实融合蛋白在转染细胞中的表达,荧光显微镜示HCBP1-EGFP融合蛋白分布于细胞浆,而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白表达载体,并在COS-7细胞中得到表达。哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1确有一定的相互作用。

丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用

目的:使用哺乳动物双杂交系统探讨HCV-core与HCBP12在人肝癌细胞HepG2细胞中的相互作用.方法:PCR分别扩增含HCV core及HCBP12的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳动物双杂交的表达质粒PBIND和PACT中,并转染HepG2细胞,48h后检测细胞中报告基因luciferase activity的表达水平.结果:Dual-Luciferase Activety系统检测显示PBIND-core与PACT-HCBP12实验组萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显高于其他阴性对照组,但低于阳性对照组.结论:哺乳动物双杂交系统证实HCV核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在人肝癌细胞系中HepG2中有一定的相互作用,为进一步研究HCV-core和HCBP12的功能奠定基础.

HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用

目的:探讨HCV-core与HCBP1的相互作用.方法:PCR分别扩增含HCV core及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEM T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果:CAT-ELISA检测显示pM-core与pVP16-HCBP1实验孔A405 nm值为0.1288,高于其它阴性对照,但低于阳性对照组A值.结论:哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1有一定的相互作用,可进一步研究HCBP1的细胞功能.

ATF1与CDK3蛋白相互作用研究

研究真核细胞转录激活因子1(activating transcription factor1,ATF1)与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶3(cyclin-dependent kinase3,CDK3)的相互作用机制,分别构建ATF1的激酶诱导区域(kinaseinducible domain,KID)结构域、谷氨酰胺富含域(glutamine rich domain,Q2)结构域及亮氨酸拉链区(basic leucine zipper domain,bZIP)结构域缺失体与VP16的融合表达载体,在HEK293细胞过表达,应用真核细胞双杂交系统,研究ATF1结构域与CDK3的相互作用.结果表明,ATF1全蛋白与CDK3蛋白之间存在强烈的相互作用;ATF1结构域缺失体与VP16的融合蛋白在HEK293细胞中可获得高表达,但ATF1的任何一种结构缺失体与CDK3蛋白结合都会严重减弱其与CDK3蛋白的相互作用,只有完整的ATF1蛋白才能实现与上游CDK3蛋白的结合.

原癌基因LMO2短剪切模式的结合蛋白鉴定及功能分析

目的研究原癌基因LMO2短剪切模式（LMO2-C）的结合蛋白在白血病细胞K562中的表达及功能分析。方法利用麦芽糖结合蛋白（MBP）沉淀技术和哺乳动物双杂交技术研究LMO2-C的结合蛋白在K562细胞中的表达；半定量RT-PCR检测过表达LMO2-C的K562细胞中红系发育的标志性基因GPA的表达水平。结果MBP原核表达系统成功表达并被纯化出可溶性MBP-LMO2-C结合蛋白，利用MBP沉淀技术验证了LMO2-C能与K562细胞中内源性的GATA-1、LDB1结合；哺乳动物双杂交试验进一步证明LMO2-C能与LDB1结合，而且其过表达能够抑制LMO2-L与LDB1的结合，抑制率达（81．13±0．68）％；半定量RT-PCR结果显示在过表达LMO2-C的K562细胞中，GPA基因相对表达水平下调（51．00±1．58）％。结论LMO2-C能结合K562细胞中内源性GATA-1、LDB1蛋白，并能下调红系发育的标志性基因GPA的表达。

FOXO1基因在中国人群非梗阻性无精子症中的突变筛查

目的探讨非梗阻性无精子症患者FOXO1基因编码区的变异。方法 PCR扩增81例中国男性非梗阻性无精子症患者和207例中国男性健康对照组FOXO1基因全编码区域,对PCR扩增产物进行测序筛查基因突变类型。随后进行功能实验来初步研究这些变异的功能。结果一名非梗阻性无精子症患者发现一个新的杂合性错义突变(p.Ser318Gly)。功能实验证实这个突变会影响FOXO1的生物学功能。结论第一次在非梗阻性无精子症患者中发现FOXO1基因的突变,表明FOXO1基因可能是导致非梗阻性无精子症发病的一个候选基因。