ManLAM对树突状细胞成熟及下游免疫的影响

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)成分带甘露聚糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan,ManLAM)对树突状细胞(dendriticcells,DCs)成熟及下游免疫的影响。方法:分离健康人外周血单个核细胞,用GM-CSF和IL-4诱导DCs生长,培养至第五天换液加细胞因子,第六天分三组,按实验设计加ManLAM和LPS。第七天收集细胞送流式检测DC-SIGN、HLA-DR、CD86、CD83表达水平;ELISA检测DCs培养上清液中IL-12和IL-10水平;混合淋巴细胞反应检测DCs诱导CD4+T淋巴细胞增值能力;DCs与初始CD4+CD45RA+T细胞共培养48小时后,ELISA检测培养上清液中IFN-γ水平。结果:(1)ManLAM组DCs表达CD86、CD83等成熟标志物较成熟DCs组下降,差异有统计学意义(P<0.05);(2)ManLAM组DCs培养上清液中IL-10水平较成熟组升高,IL-12水平较成熟组下降,差异有统计学意义(P<0.05);ManLAM组DCs刺激淋巴细胞增殖能力及刺激初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力较成熟组下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ManLAM干扰DCs成熟,下调DCs诱导的淋巴细胞增殖能力和激活初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力。

ManLAM对免疫细胞的抑制作用

甘露糖修饰的脂阿拉伯糖(ManLAM)是一种复杂的脂糖,其主要表达在结核杆菌胞壁,是结核杆菌细胞壁的主要成分。对于结核杆菌在机体内的长期生存,ManLAM起着至关重要的作用。它是结核杆菌的一种毒性因子,起着免疫抑制作用,能够作用于多种免疫细胞,包括树突状细胞、巨噬细胞、T细胞等。主要是通过减弱机体对结核抗原的递呈,Th1型细胞因子的分泌,以及对结核杆菌的吞噬杀伤来发挥作用,促进调节细胞和抑炎因子的释放发挥作用。ManLAM与机体免疫系统相互作用主要以2种方式进行:一种是与宿主细胞表面受体相互作用;另一种是通过磷脂酰肌醇锚定在宿主胞膜脂筏上发挥作用。在该篇综述中,将从机体不同免疫细胞类型来探讨ManLAM免疫抑制效应的发挥。

ManLAM对B细胞表达抑制性细胞因子IL-10的影响

目的：研究结核分枝杆菌细胞壁上的甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（ mannose-capped lipoarabinomanan,ManLAM）对小鼠B细胞的影响。方法用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv来源的ManLAM刺激小鼠脾细胞或者磁珠纯化的B细胞12 h,然后用流式细胞仪检测B细胞对抑制性细胞因子IL-10的表达情况。结果 iH37Rv（灭活的H37Rv）和ManLAM刺激小鼠脾脏细胞后,能促进其中的B细胞表达IL-10,在8-12 h内表达量达到高峰,且ManLAM能直接作用于小鼠B细胞,促进其对IL-10的表达。结论结核分枝杆菌可以通过其细胞壁上的ManLAM促进B细胞表达抑制性细胞因子IL-10,抑制机体免疫系统的正常功能,从而逃避宿主的杀害。

ManLAM结合TLR2激活肥大细胞释放外泌体诱导巨噬细胞向M2型极化

目的研究结核分枝杆菌(MTB)甘露糖冠化的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)脂糖诱导肥大细胞产生的外泌体招募并影响巨噬细胞极化从而逃避机体免疫的机制。方法培养H37Rv MTB并提取鉴定ManLAM。将提取的ManLAM处理肥大细胞,并收集其分泌的外泌体,通过蛋白质组学和Western blot法分析鉴定外泌体中蛋白质组分。将收集的外泌体与THP-1细胞诱导分化的巨噬细胞共培养,通过Transwell^(TM)实验检测肥大细胞释放的外泌体对巨噬细胞的趋化作用,流式细胞术和实时定量PCR检测ManLAM诱导的巨噬细胞极化。结果成功提取并纯化了ManLAM,并通过气相色谱鉴定其甘露糖和阿拉伯糖的比例约为12.6∶9.4;ManLAM通过与肥大细胞的Toll样受体2(TLR2)结合,产生的外泌体中CC趋化因子配体2(CCL2)、白细胞介素4(IL-4)和IL-13水平较高;ManLAM诱导产生的外泌体能够招募巨噬细胞并且促进其高表达M2型标志分子精氨酸酶1(arginase-1)、IL-10和发现于炎症区分子1(FIZZ-1)。结论 ManLAM刺激肥大细胞分泌外泌体间接诱导巨噬细胞向M2型极化使MTB逃避免疫清除。

ManLAM诱导结核性关节炎FLS细胞中IL-37表达的机制

目的使用人成纤维样滑膜细胞(FLS细胞)系探究甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(Man LAM)对人结核性关节炎中白介素-37 (IL-37)产生的作用及相关分子机制。方法从H37RV结核杆菌中提取并纯化Man LAM,提取人FLS细胞中的总RNA,将RNA反转录为c DNA。蛋白质免疫印迹法(Western Blot)对p38丝裂原活化蛋白激酶类/拮抗剂和抑制剂(p38和ERK1/2 MAPKs)进行检测。ELISA法和流式细胞术检测FLS细胞中表达出来的IL-37水平,用以评估Man LAM诱导FLS细胞中IL-37表达的能力以及观察p38和ERK1/2等抑制剂对Man LAM诱导产生的IL-37表达的影响。结果发现ManLAM诱导IL-37 mRNA及蛋白表达具有时间和剂量依赖性,然而这种活性几乎可以全部被ERK1/2 (U0126)和p38(SB203580)抑制剂所消除。TLR2表达受到干扰后,ERK1/2和p38磷酸化水平也显著下降,同时IL-37的产物也大大减少。但是干扰TLR4对Man LAM诱导IL-37的表达几乎没有影响。结论 Man LAM通过上调TLR2/p38或ERK1/2信号通路来诱导人FLS细胞中IL-37的产生,而且,这为解释Man LAM促进结核杆菌持久性的病理学作用提供了一个重要的依据。

结核杆菌表面ManLAM诱导人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37表达的研究

目的:使用A549细胞系来探究ManLAM对人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37产生的可能作用以及相关分子机制。方法:通过从H37RV结核杆菌中提取并纯化ManLAM,将纯化的ManLAM用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染分析。使用TRIzol法提取人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞中的总RNA。用逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology)对A549细胞中表达出来的IL-37进行检测。使用MAPK抗体试剂盒(Cell Signaling Technology)通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)对磷酸化的和总的p38和ERK1/2 MAPKs进行检测。针对TLR2或TLR4的siRNA或者抑制性siRNA,每5×10 5个A549细胞转染60pmol siRNA;ELISA法和流式细胞术检测A549细胞中表达出来的IL-37水平,用以评估ManLAM诱导A549细胞中IL-37表达的能力以及观察p38和ERK1/2等抑制剂对ManLAM诱导产生的IL-37表达的影响。结果:由于ManLAM是水相的主要成分,笔者发现ManLAM诱导IL-37 mRNA及蛋白表达具有时间和剂量依赖性,然而这种活性几乎可以全部被ERK1/2(U0126)和p38(SB203580)抑制剂所消除。在A549细胞中,ManLAM刺激主要是诱导ERK1/2和p38磷酸化以及细胞表面TLR2的表达。TLR2表达受到干扰后,ERK1/2和p38磷酸化水平也显著下降,同时IL-37的产物也大大减少。虽然ManLAM也能促进A549细胞中TLR4的表达,但是干扰TLR4对ManLAM诱导IL-37的表达没有影响。结论:ManLAM通过上调TLR2/p38或ERK1/2信号通路来诱导人Ⅱ型肺泡上皮细胞中IL-37的产生,而且,这为解释ManLAM促进结核杆菌持久性的病理学作用提供了一个重要的依据。

结核分枝杆菌脂糖ManLAM对CE蛋白抗原诱导的B细胞活化的影响

目的甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan,ManLAM)是结核分枝杆菌细胞壁的主要成分之一,本研究拟探究ManLAM对CE蛋白诱导B细胞抗结核免疫应答的作用及潜在机制。方法磁珠分选活动性肺结核患者B细胞,ManLAM协同CE蛋白离体刺激,CFSE检测增殖,流式检测B细胞凋亡及活化,ELISA检测细胞因子及抗体亚型分泌水平,酶联斑点试验检测B细胞分化抗体分泌细胞的水平。结果ManLAM抑制CE蛋白诱导的B细胞增殖、活化、促炎因子释放和分化为CE蛋白特异性IgG分泌细胞,但对凋亡和分化为IgM分泌细胞无显著影响。ManLAM可通过TLR2抑制CE蛋白特异性IgG1和IgG3的分泌,诱导IgG4的分泌。结论本研究证实ManLAM可抑制B细胞抗结核免疫应答,为结核分枝杆菌免疫逃逸提供了新的理论依据。

DC-SIGN的配体对肺结核患者树突状细胞黏附BCG水平的影响

目的探讨DC-SIGN的配体脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM)对肺结核患者树突状细胞黏附BCG水平的影响。方法构建带有EGFP基因的分枝杆菌穿梭质粒,电转化BCG,热诱导绿色荧光蛋白的表达,从而标记BCG;分离结核患者外周血单个核细胞,以GM-CSF和IL-4诱导树突状细胞生长,培养第5天用流式细胞术检测其表面DC-SIGN表达率,并在与不同浓度ManLAM预孵育后,与标记BCG结合,测定两者的黏附率。结果(1)分枝杆菌穿梭质粒构建成功,命名为pHSP70-EGFP。(2)用绿色荧光蛋白标记BCG成功。(3)肺结核患者外周血树突状细胞表面DC-SIGN表达率为(86.69±3.66)%。(4)伴随着ManLAM浓度的不断增加,肺结核患者外周血树突状细胞和BCG的黏附率不断下降。结论(1)可以用穿梭质粒pHSP70-EGFP在BCG中表达绿色荧光蛋白,从而标记BCG。(2)DC-SIGN分子是肺结核患者外周血树突状细胞表面结核分枝杆菌的重要受体。(3)纯化的ManLAM可以阻断肺结核患者外周血树突状细胞与BCG的黏附。