猪APOBEC3F基因真核表达载体的构建及其在MARC145细胞中的表达定位

载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3F(APOBEC3F)属固有免疫系统中的重要成员,对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多种病毒的复制具有广泛的抑制作用。为构建APOBEC3F基因的真核表达载体,并检测其在体外培养的MARC145细胞中的表达情况,通过RT-PCR从猪脾脏组织扩增APOBEC3F基因,定向克隆到表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体p EGFP-CMV中,构建p EGFP-APOBEC3F。PCR扩增及测序显示,APOBEC3F插入载体位置、方向及序列均正确。p EGFP-APOBEC3F经脂质体介导法转染MARC145细胞,转染后24 h APOBEC3F m RNA的水平升至最高。细胞免疫化学法检测发现APOBEC3F蛋白主要在MARC145细胞质中表达。研究结果为体外研究猪APOBEC3F基因在抗猪蓝耳病中的作用奠定了基础。

鸡肾型传染性支气管炎病毒适应于Marc145细胞的观察

将已适应于鸡胚肾细胞的两株北京地区 KIBV,在 Marc145细胞上盲传 5代后 ,经 IFA检测获阳性结果 ,传至第 10代后 ,光镜下出现明显的细胞病变 (CPE) ,表现为细胞部分变圆脱落 ,细胞膜界限模糊 ,细胞堆积。对细胞培养物进行免疫电镜、超薄电镜及 H.E.染色观察 ,证实了 KIBV在 Marc145细胞上的适应。两株 KIBV毒价测定 Tu2 1 TCID50 达 10 - 6.5/ 0 .1m l,Da2 1 TCID50 达 10 - 5.0 / 0 .5

Marc145细胞源EDC3基因的克隆及其生物信息学分析

为获得Marc145细胞源EDC3基因序列,分析其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本试验采用RT-PCR方法从Marc145细胞中扩增EDC3基因,并进行克隆和序列测定;应用DNAStar软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,与参考序列经BLAST比对后分析同源性,并构建系统进化树;利用生物信息学方法对其编码区蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,Marc145细胞源EDC3基因长度为1 527bp,共编码507个氨基酸;EDC3基因编码区核苷酸序列与绿猴、猕猴、狒狒、人、倭黑猩猩、马、野猪、虎鲸、绵羊、非洲象和大熊猫的同源性在91.5%~99.2%之间,与非哺乳动物原鸡同源性最低,仅为81.2%;EDC3氨基酸序列与上述物种的同源性在95.3%~99.6%之间,与原鸡的同源性仅为88.8%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源EDC3基因与绿猴的亲缘关系最近,其次是灵长类。蛋白结构预测结果表明,EDC3蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,分别为23.38%和47.35%,二级结构与三级结构预测结果相符。该蛋白存在多个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构域及信号肽区域。本试验结果可为Marc145细胞源EDC3基因功能的进一步研究提供参考。

鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞活力影响的比较研究

研究鱼腥草多糖(houttuynia cordata polysaccharide,HCP)对MA104和MARC145细胞活力的影响,筛选梯度浓度的鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞促生长最佳浓度剂量范围和毒性剂量。通过水提醇沉法提取HCP,得糖率为8.18%;分别采用MTT法和细胞平板计数法绘制MA104和MARC145细胞的生长曲线;应用MTT法检测梯度浓度HCP对MA104和MARC145细胞活力的影响。结果表明,50 mg/mL HCP对细胞活力有抑制作用(P<0.05),0.05~5 mg/mL HCP对细胞活力有促进作用(P<0.05),0~0.005 mg/mL HCP对细胞活力无显著影响(P>0.05)。结果表明,HCP(0~5 mg/mL)对MA104和MARC145细胞无毒性作用。

微载体培养Marc145细胞实验条件的优化

目的优化Marc145细胞在微载体上的生长条件。方法对微载体培养Marc145细胞的细胞接种密度、微载体浓度和细胞培养基等培养过程中的关键工程参数进行优化。结果以微载体细胞密度4×104个/mg、微载体浓度7mg/ml在高糖DMEM(含30mmol/L葡萄糖,6mmol/L Gln)培养基中培养,48h后每12h换液50%的培养方式效果最为理想。结论优化的培养工艺适用于病毒疫苗的生产。

猪繁殖与呼吸综合征病毒对Marc145细胞自噬相关基因转录的影响及分析

自噬参与多种疾病过程,且与病毒感染与增殖关系密切。为探究Marc145细胞感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12mRNA转录差异及规律、PRRSV增殖与细胞自噬的联系;采用实时荧光定量PCR方法对自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12 mRNA的转录进行测定,绘制了转录规律曲线图;并经实时荧光定量测定并绘制PRRSV在Marc145细胞中增殖规律图。结果显示,试验组自噬相关基因转录量明显高于对照组,表明PRRSV能诱导Marc145细胞自噬,且使Beclin1、ATG5和ATG12mRNA提前进入高转录状态;其转录规律与细胞病变、PRRSV增殖规律呈正相关。

Marc145细胞源DCP2基因克隆及其X1亚型蛋白高免血清制备

为分析DCP2基因的特点,研究其编码蛋白的生物学功能及其在病毒复制中的作用机制。本试验拟获取Marc145细胞源DCP2基因序列,构建其原核表达质粒,获得重组蛋白,制备高免血清。结果显示,成功获得了DCP2基因的两种转录变异体编码区,即长度为1263 bp的X1亚型和1158 bp的X2亚型,X1亚型基因序列与X2亚型相比,除了第576位碱基A变成G,第613位碱基C变成T,第945~1049位多出105 bp碱基外,其他地方完全一致。DCP2X1亚型基因编码氨基酸序列与X2亚型相比,除945~1049位多出的105 bp基因造成的第314~349个氨基酸的位置多出36个氨基酸外,其余完全一致,第576位、第613位碱基的不同并没有造成氨基酸的变化。DCP2 X1亚型蛋白二级结构与X2相比,除了多出的36个氨基酸不同外,其余地方也不一样。构建的携带DCP2 X1亚型基因的原核表达质粒,诱导表达的蛋白为不可溶性蛋白,纯化后免疫兔子,成功获得了针对DCP2 X1亚型原核表达蛋白的兔源高免血清,效价为1∶6400。本试验成功获得了DCP2基因X1、X2亚型编码区序列,并大量制得X1亚型重组原核表达蛋白及其高免血清,为进一步研究DCP2的生物学功能及其在病毒复制中的作用机制提供了必要材料。

高致病性猪蓝耳病病毒湖北分离株细胞培养特性研究

高致病性猪蓝耳病是近年来严重危害我国养猪业的一种传染病.为了探明高致病性猪蓝耳病病毒在Marc145细胞上的增殖特性,本研究在分离获得高致病性猪蓝耳病病毒湖北株的基础上进行了细胞培养特性研究.结果表明:高致病性猪蓝耳病病毒湖北株在Marc145细胞上增殖所需的最佳条件分别为:营养液最佳血清含量为10%;最佳pH值为7.2～7.4;细胞最佳培养密度为105～ 2×105/mL;病毒增殖的最佳接毒量为8×103 TCID50/mL;病毒增殖的最佳吸附时间为37 ℃,60 min;最佳收毒时间为接毒后60～84 h;病毒最佳冻融次数为反复冻融3次.

猪FcγRⅢ和γ链共转染Marc-145细胞系的建立

为了建立稳定表达猪FcγRⅢ(Porcine Fc gamma receptorⅢ,poFcγRⅢ)的Marc-145细胞系,从PAM细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅢ和γ链的cDNA,并构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅢ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞,经潮霉素B(300 mg/L)和G418(400 mg/L)共筛选获得稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系;运用RT-PCR、玫瑰花环试验和流式细胞术对细胞系进行了鉴定。结果表明,成功构建了猪FcγRⅢ和γ链真核表达载体,建立了稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系,表达于转染细胞表面的猪FcγRⅢ受体分子能与猪IgG特异结合。

猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建

目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放过程中的作用,选取源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感);利用RNAi原理,构建了以pLKO.1为载体的cathepsin基因shRNA文库;并用puromycin筛选出稳定敲减cathepsin的细胞株。结果显示:本试验构建的cathepsin-shRNA文库包含45个克隆,涉及15种cathepsin基因,筛选出的稳定细胞株中相应cathepsin基因mRNA的表达量均有显著下降。这些细胞株的构建为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。

靶向PRRSV的FnCas9-rgRNA敲除载体构建研究

为了检测靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的FnCas9-rgRNA敲除载体是否构建成功,试验先构建FnCas9-rgRNA敲除载体骨架并对其进行测序,然后将黄色荧光蛋白(EYFP)、PRRSV分别与各自的FnCas9-rgRNA敲除载体转染至HEK293、Marc145细胞内,通过流式细胞仪分析HEK293细胞内的荧光强弱及Marc145细胞的病变程度,并对FnCas9-rgRNA敲除载体的初步构建、载体活性进行研究。结果表明:FnCas9-rgRNA敲除载体骨架测序正确,流式细胞仪分析显示FnCas9-rgRNA敲除载体对HEK293细胞内EYFP基因的表达产生明显抑制作用,表达荧光的细胞数量明显下降,3种针对PRRSV设计的rgRNA分别与FnCas9表达载体共转染细胞,接种病毒后Marc145细胞病变程度明显降低。说明靶向PRRSV的FnCas9-rgRNA敲除载体构建方式正确且FnCas9-rgRNA敲除载体具有活性。

猪蓝耳病病毒CH-1R株高敏感性Marc-145细胞株的克隆与产毒试验

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞。为了进一步提高PRRSVCH-1R弱毒疫苗株在Marc-145细胞中的增殖水平,试验采用有限稀释法对Marc-145细胞进行克隆。结果表明,克隆后获得的Marc-145/D2细胞株对CH-1R弱毒株具有更高的敏感性。

猪干扰素γ诱导蛋白30基因表达载体的构建及验证

干扰素γ诱导蛋白30基因(IFI30)能够在特异抗原递呈细胞中组成性表达,在其他细胞中能被IFN-γ诱导表达,IFI30在MHC-Ⅱ限制性抗原加工递呈过程中起关键性作用。为了构建猪IFI30表达载体并验证其在体外细胞表达情况。本试验从猪肺脏组织中扩增出IFI30中长度741bp的CDS区,将其克隆到带有红色荧光的真核表达pEF1a-IRES-DsRed-Express2上,用脂质体转染法转染到Marc145细胞中,用RT-PCR以及Western blot检测其mRNA表达量和蛋白表达量。结果表明,成功构建出猪IFI30表达载体并在Marc145细胞中高效表达。