RNA干扰沉默mdrl基因联合阿霉素对卵巢癌耐药细胞株SKOV_3/ADM增殖的抑制作用

目的:观察RNA干扰沉默mdrl基因后化疗药物对卵巢癌耐药细胞株SKOV3 /ADM增殖的影响。方法:RT -PCR检测靶向于mdrl基因的小发夹状RNA(pshRNA -mdrl)对SKOV3 /ADM细胞内mdr1mRNA表达的影响;采用MTT法及软琼脂克隆形成实验测定pshRNA -mdrl联合化疗药物阿霉素对SKOV3 /ADM的增殖抑制作用。结果:pshRNA -mdrl能抑制SKOV3 /ADM细胞mdr1mRNA的表达,pshRNA -mdr1联合阿霉素明显抑制SKOV3 /ADM细胞的增殖。结论:靶向于mdr1的pshRNA联合阿霉素能显著抑制SKOV3 /ADM的增殖。

多药抗药基因Mdrl探针的克隆及初步应用

多药抗药基因Ｍｄｒｌ的表达水平与细胞的耐药性直接相关，检测Ｍｄｒｌ的表达水平可预测化疗的效果以及预后，用分子原位杂交的方法可检测单个细胞中Ｍｄｒｌ的表达水平．用ＰＣＲ扩增方法获得了一段特异的ＤＮＡ片段，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列分析证明与文献报道一致，此探针可用于临床标本的分子杂交检测．

bcl-2、bax和mdrl基因表达与急性白血病的治疗及预后

目的 :研究探讨 bcl- 2基因、bax基因和 m drl基因表达与急性白血病的治疗及预后的关系。方法 :用链亲和素—胶体金原位杂交检测了 5 6例 AL 患者的 bcl- 2、bax和 mdrl基因表达。结果 :bcl- 2和 mdrl基因低表达及 bax基因高表达患者的完全缓解率 (CR)高 ,bcl- 2 /bax比值 <0 .6患者的 CR率更明显高于 >1.2者 (P<0 .0 0 1)。结论 :bcl- 2、m dr1及 bax基因表达是 AL 相对预后不良因素 ,bcl/bax比值更是决定 AL 预后好坏的关键指标。

X射线照射K562细胞后mdrl基因表达和白血病干细胞含量的变化

目的研究白血病K562细胞经X射线照射后耐药基因mdr1表达、白血病干细胞(LSC)含量和药物敏感性的变化,探讨白血病辐射耐受性与药物耐受性的相关性。方法以白血病K562细胞为模型,直线加速器X射线照射,采用实时荧光定量PCR技术检测mdr1 mRNA表达,流式细胞术检测LSC表面标志和P-糖蛋白(P-gp)表达,MTT法测定细胞的药物敏感性。结果白血病K562细胞系mdr1基因表达和LSC含量极低,经不同剂量的X射线照射后,K562细胞中LSC的含量显著增加,mdr1/P-gp表达增高,随时间延长而逐渐降低;对阿霉素的敏感性明显降低。结论X射线照射可提高白血病K562细胞群中LSC的比例和刺激mdr1/P-gp表达,继发性地降低其对常规化疗药物的敏感性。

姜黄素逆转HL60/ADR及MCF-7/ADR的多药耐药研究

目的观察姜黄素对HL60/ADR以及MCF-7/ADR多药耐药(MDR)的逆转。方法用MTT法观察细胞的生长抑制效应,流式细胞仪检测凋亡以及细胞内阿霉素浓度,RT-PCR以及Western Blot检测Mdr1、MRP基因和Bcl-2蛋白表达。结果加入姜黄素后耐药细胞系逆转指数分别为4.18(HL60/ADR)和3.39(MCF-7/ADR),与单纯应用阿霉素相比差异有统计学意义;流式细胞仪检测显示有明显的促凋亡作用,耐药细胞系内的ADR浓度明显升高;RT-PCR以及Western Blot检测发现姜黄素对上述耐药细胞系的MRP以及Bcl-2表达有抑制作用。结论姜黄素可能作为多药耐药的逆转剂应用于MDR逆转。

基因mdr1高表达多药耐药肿瘤细胞对力达霉素的药物敏感性

目的利用经药物诱导获得的mdr1基因高表达细胞株以及通过mdr1基因转染建立的稳定高表达细胞株,研究多药耐药肿瘤细胞对力达霉素(C-1027)的药物敏感性。方法构建mdr1重组真核表达质粒pcDNA3.1/mdr1,利用脂质体转染技术,获得mdr1高表达HepG2肝癌细胞。经RT-PCR、细胞荧光免疫化学及罗丹明外排实验,鉴定了细胞的mdr1表达水平和药物外排活性。MTT方法测定敏感细胞及相对应的多药耐药细胞对力达霉素等多种抗肿瘤药物的药物敏感性。结果mdr1稳定转染细胞株HepG2/mdr1、多药耐药KBv200细胞和MCF-7/ADR细胞对力达霉素的IC50值分别为(0.020±0.011)nmol.L-1,(0.24±0.20)nmol.L-1和(0.028±0.011)nmol.L-1。相对于各自的敏感细胞,多药耐药细胞HepG2/mdr1,KBv200和MCF-7/ADR对力达霉素的抗药倍数分别是1.3,6.8和1.6倍,对阿霉素的抗药倍数分别是8.8,37.2和181.3倍,对紫杉醇的抗药倍数分别是40.3,336.8和49.2倍。结论mdr1高表达的多药耐药肿瘤细胞对力达霉素仍高度敏感,未表现出抗药性。

siRNA对SGC7901/VCR细胞mdr1基因沉默效果的影响因素分析

目的分析siRNA沉默人胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1基因效果的相关因素。方法设计并体外转录合成4条靶向mdr1的siRNA(mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞,用RTPCR和免疫印迹检测mdr1mRNA和Pgp的表达、流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性,综合这4方面结果评价4条siRNA的沉默效果情况;用分子生物学软分析siRNA沉默效果的影响因素。结果沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列编码Pgp的跨膜区而且自身无茎和袢;沉默效果较差的mdr1si3071和最差的mdr1si1513靶序列编码Pgp的胞内区,前者自身成茎和成袢。沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列在靶位点和靶位点外间有较少的碱基配对和氢键。siRNA的沉默效果与siRNA3’5’端3个碱基中的A/U数量、N1和N19、GC含量间无规律可循。结论siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果与靶序列的结构关系密切。

超剂量化疗治疗mdr1基因转染骨髓移植的VX2肝癌兔疗效和毒副作用研究

目的:mdr1基因转染的骨髓造血细胞自体移植后,观察VX2肝癌兔超剂量化疗中mdr1基因的骨髓保护及肿瘤治疗作用;并观测超剂量化疗对心脏的毒副作用。方法:mdr1基因转入兔骨髓单个核细胞并自体移植;阿霉素化疗,观测外周血白细胞数、VX2肝肿瘤的生长及转移、心脏结构和功能变化,评价mdr1基因对受体骨髓的保护作用、超剂量化疗对肿瘤的治疗作用及对心脏的毒副作用。结果:通过转染的自体骨髓移植将mdr1基因导入受体骨髓;超剂量阿霉素化疗后,实验组荷瘤兔外周血白细胞可维持在(4.26±1.03)×109/L,肿瘤能被有效杀灭,荷瘤动物的生存时间明显高于对照组(P<0.05);同时也观察到超剂量化疗对心脏的严重损害。结论:mdr1基因能明显提高骨髓对化疗的耐受性;超剂量化疗能有效杀灭肿瘤,同时也对非造血系统脏器造成严重损害。

小分子干扰RNA逆转胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药

目的研究小分子干扰RNA(siRNA)逆转胃癌多药耐药细胞亚系SGC7901/VCR mdr1介导的多药耐药效应。方法根据mdr1cDNA已知序列,设计并体外转录2条含21个核苷酸的siRNA(mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞,用RT-PCR检测mdr1基因mRNA的表达,免疫组织化学检测P-gp的表达,流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果siRNA转染SGC7901/VCR细胞48 h后,mdr1基因mRNA和P-gp的表达水平下降,细胞内阿霉素积累量增加,对阿霉素敏感性的相对逆转率各达79.59%及59.98%。结论siRNA可逆转SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药。

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K 562/A 02多药耐药基因m d r1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性。方法针对m d r1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向m d r1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K 562/A 02。实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,W esternb lot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,M TT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果构建了二条针对m d r1基因的shRNA真核表达载体,分别下调m d r1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60m in时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%。结论RNA干扰技术可有效逆转m d r1所致耐药。

抑制mdr1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的:探讨用反义技术抑制癌基因mdr1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响。方法:设空白组、mdr1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)为对照组以及mdr1反义寡核苷酸组,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后mdr1表达水平的变化。用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达。结果:mdr1反义寡核苷酸能有效地抑制mdr1癌基因的表达,经脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P<0.05)。结论:mdr1反义寡核苷酸通过抑制mdr1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性。其辐射增敏作用可能与mdr1反义寡核苷酸增加照射后肿瘤细胞的凋亡率有关。

mdr1 shRNA逆转膀胱癌耐药细胞株BIU-87/ADM对ADM的耐药性

目的构建抑制mdr1基因表达的短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,研究shRNA逆转膀胱肿瘤细胞多药耐药的可行性。方法针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择2个靶序列,构建靶向mdr1shRNA真核表达载体,通过脂质体介导转染膀胱肿瘤耐药细胞株BIU-87/ADM,利用RT-PCR和免疫细胞化学检测mdr1mRNA及P糖蛋白(P-gp)表达水平的变化,MTT法检测BIU-87/ADM细胞对ADM的敏感性。结果构建的2种重组质粒pshRNA-A、pshRNA-B均明显抑制BIU-87/ADM细胞株mdr1基因表达(P<0.05),免疫细胞化学检测显示P-gp表达明显下调(P<0.05),MMT法检测显示膀胱癌耐药株BIU-87/ADM对化疗药物ADM的敏感性明显增强,对ADM药物敏感性的相对逆转效率分别为52.02%和54.87%(P<0.05)。结论shRNA可有效抑制BIU-87/ADM细胞mdr1mRNA的转录和P-gp蛋白的表达,恢复BIU-87/ADM细胞对ADM的敏感性,给逆转膀胱肿瘤的多药耐药提供了一种新的方法。

MDR1-mRNA在原发性大肠癌中定量测定及临床意义

目的探讨大肠癌mdrl基因与肿瘤生物学行为的关系及mdrl基因表达分级标准制定的临床意义。方法采用RTPCR方法检测了65例大肠腺癌患者肿瘤组织中mdrl基因表达水平并进行程度分级。结果mdrl基因表达水平与大胸腺癌分化程度相关，但与肿瘤侵袭程度、淋巴结转移程度及远处转移与否无关。结论用mdrl／β2-MG可较准确表示肿瘤标本中mdrl的相对含量：mdrl的表达水平与肿瘤恶性程度有关，而与其发展过程无关。mdrl基因表过程度的分级对大肠癌患者个体化化疗有指导意义。

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制。方法将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性。结果EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞。结论实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长。

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｍｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢ－Ｓｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍｄｒｌ基因的病毒具有相似的滴度。用此三种病毒分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后，以ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ载体ｍｄｒｌ基因产物表达量最高。提示Ｈａｒｖｅｙ肉瘤病毒的启动子可能具有较高的强度。

靶向mdr1基因转录小发夹RNA重组质粒的构建和序列分析

目的 构建针对多药耐药基因(mdrl)编码区的发夹状RNA重组质粒载体pshRNA-mdrl,并行序列分析,为下一步逆转肿瘤的多药耐药性打下基础。方法 设计含19-21bp mdrl编码基因片段及中间以4个bp间隔的反向重复序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pTZU6+1上,转化JM109茵株,提取重组质粒酶切鉴定并序列分析。结果 将合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列。结论 靶向mdrl基因发夹状RNA干扰重组质粒的成功构建,可进一步研究其对mdrl mRNA转录的抑制,达到逆转肿瘤的多药耐药性的目的。

敏感和抗性的白血病HL60细胞对staurosporine诱导凋亡的不同反应(英)

用对蛋白激酶具有强烈抑制、作用广泛的抑制剂staurosporine（Sta），研究敏感和抗三尖杉酯碱的人白血病HL60细胞中凋亡和多药抗药性的关系．Sta均能诱导2种细胞发生典型的凋亡，但抗性细胞发生凋亡需更长的时间，凋亡的细胞数减少．Sta增加柔红霉素在抗性细胞内的积聚，说明其能逆转多药抗药性．在抗性细胞凋亡过程中，mdrl基因表达没有变化，c-myc基因表达稍有增加．结果显示：Sta能诱导敏感和抗三尖杉酯碱的HL60细胞发生凋亡，mdrl基因表达与凋亡过程无关．

多药耐药基因Mdr1 RNA探针的构建及初步临床应用

检测 Mdrl基因表达水平可预测白血病化疗效果 ,用原位杂交的方法可检测 Mdrl在单个细胞的表达水平。本文用Rt- PCR的方法获得了一段特异的 c DNA片段 ,将其克隆到 PGEM4Z载体中 ,经 DNA序列分析证明与文献报道一致。采用地高辛素 (DIG) RNA标记试剂盒制备反义 RNA探针 。

热带念珠菌外排泵耐药的研究

目的研究耐氟康唑热带念珠菌临床株F c30的外排泵耐药机制。方法运用半定量RT-PCR技术研究外排泵基因m d r1 mRNA水平与耐药的相关性。结果耐药株F c30的m d r1基因mRNA灰度比值约为敏感株F c17的2.3倍。结论与敏感株相比,耐氟康唑热带念珠菌F c30外排泵基因m d r1过度表达与耐药相关。

多药耐药基因的人骨髓细胞转染及其对抗癌药的抗性增强作用

为探讨mdrl基因转染增强人骨髓细胞对抗癌药的抵御能力的可能性。通过脂质体介导 ,用含人mdrlcDNA表达质粒 pHaMDR1/A ,将mdrl基因转染人骨髓细胞 ,分别采用流式细胞术和免疫组化检测转染细胞mdrl基因的表达产物———P糖蛋白 (Pgp) ,并用罗丹明试验证实其生物活性。同时 ,采用集落培养及抗性试验检测mdrl基因转染的人骨髓细胞对阿霉素、秋水仙碱、长春新碱和Vp16的抵御能力。结果mdrl基因被成功地导入了人骨髓细胞并获得了表达 ,罗丹明试验证实了Pgp具有完整的生物功能。mdrl基因转染的人骨髓细胞对上述抗癌药的抵御能力明显增强。