木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因克隆与序列分析

【目的】克隆木纳格葡萄果实中谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)基因VvGST1全长并研究其序列特征,为该基因在葡萄果实抗病作用和功能的研究奠定基础。【方法】根据已有的基因序列,设计3'和5'端RACE引物,利用RT-PCR和RACE技术克隆VvGST1基因cDNA全长。【结果】该基因序列全长719 bp,均为开放阅读框(ORF),共编码221个氨基酸。该基因编码蛋白相对分子质量为25.55 kDa;理论等电点pI值为6.32;分子式为C_(1178)H_(1799)N_(293)O_(321)S_(11);不稳定指数为39.22;该蛋白质是稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,没有预测到信号肽,可能存在于细胞基质中,是典型的基质蛋白。VvGST1氨基酸序列与棉花、桃、西梅、樱桃、李子、板栗等植物聚为一类,其中与棉花属亲缘关系最近。【结论】获得了木纳格葡萄谷胱甘肽-S-转移酶VvGST1基因全长编码序列,探明了该序列的结构特征。

香蕉3个Tau类谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及序列分析

为了获得香蕉抗逆相关基因,通过随机克隆测序和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)的方法从香蕉根系cDNA文库中获得3个谷胱甘肽硫转移酶基因,命名为MaGSTU1、MaGSTU2和MaGSTU3(GenBank登录号分别为:KC261934、KC261935和KC261936)。经5′RACE获得3个GST基因全长,分别包含1个627、675和699 bp的最大开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),分别编码208、224和232个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST_N_Tau和GST_C_Tau结构域。系统发育树显示所有Tau类GST基因聚成一大支,充分说明本研究克隆的3个基因为Tau类GST基因。这些结果为进一步分析该类基因的功能和今后香蕉抗逆分子育种提供了基础资料。

向日葵谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及抗病功能研究

为探讨谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因在向日葵抗病机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个GST的c DNA序列,并进行了表达和功能分析。结果表明:该基因开放阅读框为675bp,编码224个氨基酸残基,分子量为55.45k D,等电点为5.16,命名为Ha GSTU1(Gen Bank登录号为KR071872);Ha GSTU1蛋白属于GST的Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;Ha GSTU1与一个橡胶树GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为72%。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在叶中表达量最高,其次是花、根、种子和茎,在盘中的表达量最低;干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导向日葵Ha GSTU1基因的表达量出现显著变化。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因烟草叶片对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草GST和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定发现,转基因烟草叶片中GST和GPX酶活性较野生型提高约2倍,并随着接菌时间的延长,两种酶活性显著升高。初步推断Ha GSTU1具有抗核盘菌的功能。

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.

三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蜕皮周期中的表达水平

为了研究法尼酸甲基转移酶(FAMeT)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到了三疣梭子蟹FAMeT的全长cDNA序列(GenBank登录号:KC192659),它包括一个201 bp的5'非编码区、一个318 bp的3'非编码区和一个825 bp的开放阅读框(ORF),编码274个氨基酸;推导的氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物FAMeT进行比对,发现一致性达75%～97%,其中与远海梭子蟹FAMeT的一致性最高;而且该氨基酸序列由两个CF(CPAMD8/FAMeT)区域组成,这两个CF区域是FAMeT的标志,在所有甲壳动物的FAMeT里均有发现,因此推导的氨基酸序列是三疣梭子蟹FAMeT基因。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分析了其在不同组织中、不同蜕皮周期中的表达量变化,发现FAMeT在三疣梭子蟹的各个组织里均有表达,且在胸神经节里表达最强;在三疣梭子蟹蜕皮过程中,大颚器中FAMeT在D1期表达最强,然后逐渐下降至D4最低。该结果表明FAMeT在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要的作用。

鳜鱼两种谷胱甘肽S-转移酶基因cDNA的克隆与分析

鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国著名的肉食性鱼类,容易成为环境毒素的富集体.论文从分子水平上分析了鳜鱼去毒过程中起关键作用的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的结构及进化上的地位,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到了鳜鱼肝脏可溶性alpha型(GSTA)和rho型(GSTR)基因cDNA全序列.结果表明,鳜鱼肝脏GSTA、GSTR全长分别为1052bp、935bp,其中5′-UTR分别为118bp、55bp,3′-UTR分别为262bp、202bp,分别编码223、225个氨基酸.系统分析结果显示:鳜鱼GSTA与GSTR在进化树上的位置与其分类所处的位置基本吻合.

近江牡蛎4种类型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究不同类型谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因在近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)等贝类体内代谢去毒过程中的作用,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到近江牡蛎肝脏4种类型GST基因cDNA全序列.序列分析结果表明,mu、pi、omega、sigma4种类型GST基因cDNA全长分别为970bp、773bp、999bp、1277bp,分别编码215、207、242、203个氨基酸.构建系统进化树发现,除太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)pi型GST外,所有类型GSTs序列都能各自聚集成一簇.

飞蝗谷胱甘肽S-转移酶基因克隆、序列分析及表达特征

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类广泛分布的多功能超家族酶系,其中Omega家族GST在昆虫体内担负重要生理功能。为探讨飞蝗Locusta migratoria Omega家族GST功能,利用RT-PCR技术克隆得到1条飞蝗谷胱甘肽S-转移酶Omega家族基因全长cDNA,命名为LmGSTo1(GenBank登录号:JQ750592)。该基因开放阅读框长738bp,编码245个氨基酸。该酶含有N-端和C-端2个结构域,N-端结构域由5个β-折叠和3个α螺旋组成,包括4个GSH结合位点;C-端结构域由8个α螺旋组成,含有5个底物结合位点。Real-timePCR结果表明,LmGSTo1在飞蝗不同龄期均有表达,在胃盲囊和中肠表达量较低,在前肠、马氏管、肌肉和脂肪体表达量较高;溴氰菊酯处理可导致LmGSTo1表达水平显著下降。这些结果为进一步研究LmGSTo1基因功能提供了依据。

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486 kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT(P51094.2)的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。

云南野生黄牡丹谷胱甘肽转移酶(GST)基因的分离及表达分析

从已构建的云南野生黄牡丹花瓣转录组数据库中得到10个与花色素转运相关的谷胱甘肽转移酶(GST)蛋白同源性高的Unigene序列,分别命名为Pl GST1-10。利用RT-PCR和RACE技术对Pl GST1-10最大阅读框(ORF)序列扩增并进行氨基酸序列比较和系统进化树分析,结果显示:Pl GST5可能与花色素转运相关,包含1个675 bp的开放阅读框,编码1个224个氨基酸的蛋白,含有2个内含子和3个外显子,属于phi型GST;其氨基酸序列与葡萄Vv GST4、矮牵牛Ph An9、仙客来Ckm GST3、拟南芥At TT19、瓜叶菊Sc GST3和香石竹Dc GSTF2等花色素转运GST具有较高的相似性。Pl GST5在不同花色的花发育时期及盛开期的不同组织的qRT-PCR分析表明Pl GST5在花色素积累较多的组织中高丰度表达,在黄牡丹和紫牡丹的盛开期表达量最高,而在牡丹品种‘赵粉’和‘玉板白’的花发育早期表达量最高。推测Pl GST5参与黄牡丹花色素转运。

水稻OsSAMT1基因的克隆及其遗传转化

采用RT-PCR法从水稻中成功克隆了1个水杨酸甲酯转移酶基因(OsSAMT1),构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法转化粳稻品种日本晴,获得10个转基因阳性植株.生物信息学分析结果表明,水稻基因组中共有12个OsSAMT1的同源基因,它们分别属于第6和第11号染色体上的2个基因族,而位于第2号染色体上的OsSAMT1基因与第6号染色体上的同源基因具有更高的相似性.

黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)的克隆及特征分析

为了分析黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)在果实发育不同模式中的转录变化以及对不同激素的转录应答情况,对CsIPT2基因进行了克隆和序列分析,再利用荧光定量PCR技术分析该基因在黄瓜单性结实自交系EC1和非单性结实自交系8419s-1果实发育过程中的表达情况,并分析了CsIPT2对不同激素的应答反应。结果表明:CsIPT2基因全长843 bp,共编码280个氨基酸,蛋白空间结构模型与蛇麻IPT蛋白极其相似。该基因不仅在授粉后的黄瓜果实发育中表达量上调,而且在黄瓜天然单性结实前期和人工诱导的单性结实后期表达量均有增加,推测该基因在促进黄瓜果实发育过程中发挥着重要作用,同时也可能参与了黄瓜单性结实的调控过程。GA、ET、6-BA、ABA和NAA 5种激素都能够诱导该基因的上调表达。其中GA处理后3 h基因表达量最高,ET、6-BA、ABA和NAA诱导的表达峰值出现在处理后6 h。随着NAA处理浓度的增加基因的表达量上调幅度增大。

斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.

二斑叶螨抗螺螨酯品系GST基因的克隆与表达分析

【目的】揭示二斑叶螨Tetranychus urticae对螺螨酯的分子抗性机理。【方法】利用RT-PCR克隆了二斑叶螨的谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析了克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量PCR方法分析GST基因在二斑叶螨的螺螨酯抗性与敏感品系中的表达差异。【结果】克隆获得的谷胱甘肽-S-转移酶2个基因分别被命名为TuGSTd1和TuGSTd2(GenBank登录号分别为:KC445659和KC445660)。序列分析发现,TuGSTd1的开放阅读框长度为648bp,编码215个氨基酸,分子量约为24.47kDa,理论等电点为5.49;TuGSTd2的开放阅读框为648bp,编码215个氨基酸,分子量约为24.57kDa,理论等电点为6.33。系统发育分析表明这两个基因与桔全爪螨Panonychus citri Delta家族的GST基因的氨基酸序列一致性为93%。实时荧光定量PCR结果表明,TuGSTd1和TuGSTd2在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量分别为敏感品系的5.60和3.75倍。【结论】GST基因在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量均显著高于敏感品系,据此推测GST基因的过量表达可能与其对螺螨酯的抗性形成有关。

Sj28GST基因克隆和高效表达产物的纯化

目的 从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆 2 8kDa谷胱甘肽 -S -转移酶 (Sj2 8GST)基因 ,获得用于疫苗和T细胞表位研究的高纯度重组融合蛋白 2 8GST -TRX。方法 应用引物特异性PCR技术 ,从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中扩增Sj2 8GST基因 ,经琼脂糖凝胶电泳结合碱基序列分析鉴定后 ,采用定向克隆技术构建Sj2 8GST -TRX融合蛋白重组表达载体并诱导其在大肠杆菌BL2 1(DE3)的表达 ,用Western -blotting测定以融合蛋白方式表达的Sj2 8GST的免疫原性 ,通过包涵体纯化结合Ni+柱亲和层析获得高纯度重组融合蛋白。结果 Sj2 8GSTPCR产物为约 6 4 0bp ,其碱基序列 (6 33bp)和推导的氨基酸序列 (2 11aa)与GenBank报道一致 ;获得了Sj2 8GST -TRX重组质粒 ;2 8GST -TRX融合蛋白在大肠杆菌以包涵体形式高效表达 ;在分子量为约 4 3kDa处有一能与羊抗Sj2 8GST抗体产生特异性反应的含 2 8GST融合蛋白条带 ;包涵体纯化法结合Ni+ 亲和层析可获得高纯度的重组融合蛋白。结论 获得到了日本血吸虫中国大陆株 2 8GST分子的全长基因和高纯度重组 2 8GST -TRX融合蛋白 ,该融合蛋白具有天然Sj2 8GST免疫原性。

高羊茅FaGST1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆高羊茅谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因FaGST1,并进行亚细胞定位及表达分析,为深入研究该基因的抗逆分子调控提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE从高羊茅黔草1号中克隆FaGST1基因,对其进行生物信息学分析,构建植物融合表达载体pCAMBIA1300-FaGST1-GFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察FaGST1基因亚细胞定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测高盐、高温、干旱及低氮胁迫处理下高羊茅叶片中该基因的表达情况。【结果】克隆获得FaGST1基因cDNA全长序列为1003 bp,开放阅读框(ORF)为681 bp,编码227个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量约25.60 kD,理论等电点(pI)为5.58,亲水指数平均值-0.342,不稳定系数32.96,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核。FaGST1蛋白二级结构中,α-螺旋占50.44%,β-转角占5.75%,无规则卷曲占30.54%,延伸链占13.27%。FaGST1蛋白的保守结构区域为含有G位点的N末端结构域和含有H位点的C末端结构域。FaGST1蛋白与黑麦草GST蛋白(AMY26594.1)的氨基酸序列相似性最高,为93%,其次是海滨雀稗GST蛋白(AMN87043.1),为91%,与玉米(ACG39365.1)和小米(KQK86785.1)GST蛋白氨基酸序列相似性均在80%以上,与系统发育进化树分析结果基本相符,即FaGST1蛋白与黑麦草、海滨雀稗、玉米和小米等禾本科植物GST蛋白亲缘关系较近。高羊茅FaGST1基因在干旱、高温、高盐胁迫和低氮胁迫处理下均出现抑制表达。【结论】FaGST1基因负向调控高羊茅逆境胁迫响应。

烟夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆、序列分析与表达

为探明谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)在昆虫嗅觉识别中的作用,本研究采用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guenée)雄虫触角中克隆获得了1个GSTs基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为EU289223)。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性比对和系统发育分析,发现该蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,因此将该基因命名为HaGSTe1。同时从烟夜蛾基因组DNA中克隆获得了该基因序列,发现序列中含有5个内含子,长度分别为415,513,296,333和269bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对HaGSTe1在雌、雄虫不同组织的表达进行了定性和定量分析,结果显示,该基因在雌、雄虫的头部(去掉触角和喙)、触角、喙、胸、足、翅以及雌虫的腹部均有表达,并且在雄虫触角中的表达量最高,且显著高于雌虫触角,这种表达情况提示其可能与触角中性信息素及其他外源物质的分解有关。

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。

结核分枝杆菌鼠李糖基转移酶基因(wbbL)的克隆和表达

[目的 ]从结核分枝杆菌基因组DNA中克隆鼠李糖基转移酶基因 (rhamnosyltransferase ,wbbL) ,并利用 pET16b表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株中高效表达wbbL基因产物 -鼠李糖基转移酶。 [方法 ]利用PCR方法从结核分枝杆菌H 37Rv菌株的基因组DNA中扩增出wbbL基因 (90 6bp)并克隆到 pMD18-T克隆载体中 ,经DNA序列测定证实为正确的基因后 ,将其亚克隆到表达载体 pET16b中并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达wbbL基因产物。 [结果 ]1)从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA中PCR扩增出正确的wbbL基因 ;2 )经IPTG诱导wbbL基因在BL2 1(DE3)中高效表达出wbbL基因产物。 [结论 ]1)用具高保真性的LATaqDNA聚合酶所扩增的结核分枝杆菌的wbbL基因经BLAST分析与结核分枝杆菌基因组数据库 (http :/ /www .sanger .ac .uk)中所公布的序列完全一致 ;2 )从大肠杆菌BL2 1(DE3)所获得的大量鼠李糖基转移酶 ,为进一步纯化该酶并研究其酶促反应动力学特性提供了物质保障。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。