负载MAGE-A3抗原的树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响

目的:探究负载黑色素瘤相关抗原基因A3(MAGE-A3)的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响。方法:采集人外周血分离单个核细胞,利用细胞因子分别诱导生成DC和CIK;MAGE-A3孵育DC后与CIK共培养,流式细胞仪检测DC-CIK、MAGE-A3-DC-CIK的表型;流式细胞仪分选子宫内膜癌细胞系Ishikawa的CD133^(+)干细胞,以子宫内膜癌干细胞作为靶细胞,分别以CIK、DC-CIK及MAGE-A3-DC-CIK作为效应细胞,MTT法检测效靶比为10∶1、20∶1、40∶1的细胞杀伤活性,ELISA法检测联合培养细胞上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17水平,Annexin V-FITC/PI双染法检测子宫内膜癌干细胞凋亡;建立子宫内膜癌干细胞移植瘤裸鼠模型,尾静脉注射DC-CIK或MAGE-A3-DC-CIK,观察裸鼠肿瘤生长情况,每隔2 d测量瘤体大小,21 d后取肿瘤组织,电子天平称重,HE染色观察肿瘤组织病理形态学变化,免疫组织化学染色检测肿瘤组织内Ki-67表达。结果:分离获得细胞表面CD80、CD86、HLA-DR表达分别达到88%、86%和90%的DC;MAGE-A3-DC-CIK组细胞表面CD8^(+)CD3^(+)、CD56^(+)CD3^(+)比例均高于DC-CIK组(P<0.01);经磁珠分选后获得CD133^(+)细胞比例高达90.23%的子宫内膜癌干细胞;与CIK组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组在不同效靶比下对子宫内膜癌干细胞的杀伤能力升高,细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-12及IL-17的分泌水平升高,培养液上清处理的子宫内膜癌干细胞凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01);同时,与对照组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组移植瘤裸鼠的肿瘤体积小,肿瘤重量轻,肿瘤组织内细胞稀疏,Ki-67阳性细胞率减小,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:负载MAGE-A3的DC与CIK联合培养能促进CIK成熟,提高对子宫内膜癌干细胞的杀伤性,并抑制移植瘤裸鼠的恶性进展。

MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞治疗小鼠乳腺癌移植瘤

目的研究黑色素瘤相关抗原基因A3(MAGE-A3)抗原肽负载树突状细胞(DCs),在乳腺癌动物模型免疫治疗中的作用。方法采用MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞,过继免疫治疗乳腺癌的小鼠模型,观察其治疗效果。结果抗原负载的DCs治疗组的生存率(100%)、抑瘤率(76·3%)明显高于对照组(P<0·05);肿瘤转移率(22·2%)低于对照组(P<0·05)。同时,治疗组的小鼠生存质量高于对照组。结论MAGE-A3抗原肽负载DCs疫苗是一种比较安全有效的治疗方法。

重组腺病毒Ad-CRT/MAGE-A3联合表柔比星抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭

目的:构建携带钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因和黑素瘤抗原基因-A3(melanoma antigen gene-A3,MAGE-A3)的重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3,观察其联合表柔比星对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及侵袭的抑制作用。方法:构建Ad-CRT/MAGE-A3载体,感染MDA-MB-231细胞后,荧光显微镜观察其最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)。分表柔比星、Ad-GFP、Ad-CRT/MAGE-A3、表柔比星+Ad-GFP、表柔比星+Ad-CRT/MAGE-A3共5组,MTT法检测各组MDA-MB-231细胞的增殖,Transwell实验检测各组MDA-MB-231细胞的侵袭力。结果:成功构建重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3,其感染MDA-MB-231细胞的最适MOI为100。与其他各组相比,应用Ad-CRT/MAGE-A3联合表柔比星能明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖[(83.27±1.04)%vs(57.42±1.27)%,(43.26±0.95)%,(61.23±1.47)%,(55.38±1.62)%;P<0.05]和侵袭[(8.41±4.20)vs(14.62±5.33),(107.66±3.35),(100.60±4.42),(104.20±2.60);P<0.05]。结论:腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3能增强表柔比星抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及侵袭的能力。

胃癌中CAGE、MAGE-A1和MAGE-A3的去甲基化

目的:探讨肿瘤相关抗原基因(cancer associated antigen gene,CAGE)、黑色素瘤抗原基因-A1(melanoma antigen gene A1,MAGE-A1)、黑色素瘤抗原基因-A3(melanoma antigen gene A3,MAGE-A3)启动子区去甲基化与胃癌临床特点的关系和意义.方法:应用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法检测30例胃癌和25例正常胃黏膜标本中CAGE、MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子区的去甲基化状态,并分析其与胃癌临床病例参数间的关系.结果:胃癌组CAGE、MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子去甲基化阳性率(80.0%、60.0%、46.7%)均明显高于正常胃黏膜组(4.0%、0.0%、8.0%,P<0.05).胃癌组中,CAGE基因启动子区去甲基化与淋巴转移和临床分期有关(P=0.016;P=0.026);MAGE-A1基因启动子区去甲基化与组织分化程度和临床分期有关(P=0.042;P=0.002);MAGE-A3基因启动子区去甲基化与淋巴转移和组织分化程度有关(P=0.034;P=0.026).结论:CAGE、MAGE-A1和MAGE-A3基因启动子区去甲基化的检测可能有助于判断胃癌的组织分化程度、淋巴结转移和临床分期,有可能成为胃癌治疗及判断预后的分子标志物.

鼻颅底肿瘤SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应水平及其临床意义

目的:探讨鼻颅底肿瘤人类婆罗双树样基因-4(SALL4)和黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)特异性CTL免疫反应水平及其临床意义。方法:收集2016年5月至2017年12月期间在南阳市中心医院经病理学确诊的鼻颅底肿瘤患者62例作为研究对象。统计所有入选对象血清SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应水平数据,分析血清SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率及强度与患者临床病理参数的关系。以患者4~18个月的随访结果进行分组,将随访期间出现肿瘤复发、转移或死亡等任意一项的患者纳入不良组,其余纳入良好组。绘制ROC曲线分析血清SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应水平预测患者预后的效能。结果:鼻颅底肿瘤患者血清中SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率分别为58.06%(36/62),54.84%(34/62),反应强度分别为4 089.26±263.76 SFC/106 PBMC,2 389.17±167.53 SFC/106 PBMC。血清SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率及强度在患者的分化程度、肿瘤大小、肿瘤侵袭性之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),在TNM分期I^II期与III^IV期的对比,差异有统计学意义(P<0.05)。为期4~18个随访统计,预后不良者30例(48.39%),预后良好者32例(51.61%)。通过ROC曲线分析及最大约登指数计算出血清SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率及强度的AUC面积为SALL4(0.853),MAGE-A3(0.765)。以最大约登指数计算得出SALL4,MAGE-A3指标的最大AUC面积相应参数截止值,其中SALL4截止值为3 789.178 SFC/10~6 PBMC(灵敏度=81.70%,特异性=92.60%),MAGE-A3截止值为2 342.275 SFC/10~6 PBMC(灵敏度=77.40%,特异性=81.30%)。结论:鼻颅底肿瘤SALL4,MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率及强度与患者TNM分期密切相关,在预测患者预后方面具有较强的特异性和灵敏度。鼻颅底肿瘤患者血清SALL4,MAGE-A3免疫反应水平对预后诊断具有指导价值。

黑色素瘤抗原A3基因对肝细胞癌免疫保护作用

目的：构建小鼠黑色素瘤抗原A3 （MAGE-A3）基因真核表达载体,观察其对小鼠肝细胞癌的免疫保护作用.方法：化学合成小鼠MAGE-A3全长基因,以pcDNA3.1（＋）质粒为载体,构建重组表达载体pcDNA3.1-MAGE-A.将pcDNA3.1（＋）-MAGE-A3载体转染293T细胞,免疫印迹鉴定转染细胞MAGE-A3蛋白的表达.将纯化的重组质粒DNA肌肉注射免疫小鼠,5-Aza-Cdr诱导小鼠肝癌细胞H22表达MAGE-A3基因,观察小鼠成瘤情况与瘤体形态学改变.结果：成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染293T细胞后能正常高效表达MAGE-A3蛋白;MAGE-A3重组质粒DNA免疫小鼠后,小鼠成瘤的时间推迟,瘤体生长速度明显减慢,瘤体大小和质量与对照组相比,差异有统计学意义;光镜下显示MAGE-A3重组质粒组肿瘤细胞排列较为稀疏,间质炎症细胞浸润和淋巴细胞增殖更为明显.结论：MAGE-A3基因免疫可有效抑制肝细胞癌成瘤,产生对肝癌的免疫保护作用,提示MAGE-A3基因疫苗可作为肝癌防治手段之一.

喉癌来源黑色素瘤抗原A3在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达

目的:建立pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤B16细胞稳定表达的肿瘤细胞模型。方法:将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3,脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检查MAGE-A3在B16细胞中的转录。结果:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光,qRT-PCR可检测到MAGE-A3 mRNA的转录。结论:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒通过脂质体法能有效转染,并在B16稳定表达,成功建立了MAGE-A3肿瘤细胞模型。

NY-ESO-1和MAGE-A3在进展期胃印戒细胞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨纽约食管鳞状上皮癌抗原-1(NY-ESO-1)和黑色素瘤抗原基因-A3(MAGE-A3)在进展期胃印戒细胞癌组织中的表达和临床意义。方法收集2004年4月至2014年7月进展期胃印戒细胞癌组织81例,采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中NY-ESO-1和MAGE-A3的蛋白表达水平。统计分析两者表达与临床病理特征和预后的关系。结果81例胃印戒细胞癌组织中NY-ESO-1的阳性表达率为9.9%(8/81),MAGE-A3的阳性表达率为28.4%(23/81)。NY-ESO-1和MAGE-A3的表达呈正相关(r=0.25,P=0.024)。NY-ESO-1表达与TNM分期和神经侵犯有关(P<0.05),与年龄、性别、病理类型、Lauren分型、肿瘤位置和脉管侵犯无关(P>0.05)。MAGE-A3表达与年龄有关(P=0.020),而与性别、TNM分期、病理类型、Lauren分型、肿瘤位置、神经侵犯和脉管侵犯无关(P>0.05)。NY-ESO-1阳性表达患者的中位总生存时间(OS)为13.0个月(95%CI:0~40.7个月),阴性表达者为20.5个月(95%CI:16.6~24.4个月),差异无统计学意义(P=0.605)。MAGE-A3阳性表达患者的中位OS为20.5个月(95%CI:8.0~33.0个月),阴性表达者为20.0个月(95%CI:15.1~24.9个月),差异无统计学意义(P=0.922)。结论NY-ESO-1和MAGE-A3在进展期胃印戒细胞癌组织中均有一定程度的表达,两者作为靶点的免疫治疗在胃印戒细胞癌中的潜在价值值得进一步探索。

负载乙肝核心抗原-黑色素瘤抗原-A3融合蛋白的外周血单个核细胞对人非小细胞肺癌细胞体外杀伤作用的实验

目的研究经负载乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen,HBVc)-黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene-A3,MAGE-A3)融合蛋白的外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC)激活的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)对MAGE-A3高表达人非小细胞肺癌细胞的特异性体外杀伤作用。方法从健康人外周血中分离出单个核细胞(peripheral blood monocyte cell,PBMC),使用白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)刺激PBMC,将负载HBVc-MAGEA3融合蛋白的PBMC与正常PBMC共培养,诱导出特异性细胞毒性T淋巴细胞,以该共培养后的PBMC作为效应细胞,以高表达MAGE-A3抗原的人非小细胞肺癌细胞株NCI-H358为靶细胞,低表达MAGE-A3抗原的细胞系HEK-293T作为对照,进行肿瘤细胞杀伤试验。结果负载HBVc-MAGE-A3融合蛋白抗原的外周血单个核细胞能够成功诱导出特异性的细胞毒性T淋巴细胞,并且对非小细胞肺癌细胞有显著的杀伤作用,其杀伤率显著高于对照组(P<0.05)。当使用MAGEA3高表达的NCI-H358细胞作为靶细胞,效靶比(E∶T)=10∶1时,HBVc-MAGE-A3组的杀伤率约为60%,HBVc组和空白对照(no template control,NTC)组的杀伤率约为35%;E∶T=20∶1时,HBVc-MAGE-A3组的杀伤率约为90%,HBVc组和NTC组的杀伤率约为45%。当使用MAGE-A3低表达的HEK-293T作为靶细胞时,三组间杀伤率差异无统计学意义。结论 MAGE-A3融合蛋白抗原负载的外周血单个核细胞可以在体外成功诱导出特异性针对非小细胞肺癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞,并具有特异性免疫杀伤作用。

宫颈癌患者外周血黑色素瘤抗原基因-A3、基因-A6表达意义

目的:检测宫颈癌患者外周血循环中黑色素瘤抗原基因-A3(MAGE-A3)和黑色素瘤抗原基因-A6(MAGE-A6)的表达水平并阐述其临床意义。方法:收集2015年6月—2016年6月本院妇科诊治的宫颈癌患者85例(观察组)和体检健康志愿者85例(对照组)取静脉血分离单核细胞,采用荧光定量PCR技术检测各组MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA表达水平,分析与宫颈癌患者临床指标关系。随访宫颈癌患者5年,记录生存状态,Kaplan-Meier法分析MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA表达水平与宫颈癌患者预后的关系。结果:观察组血MAGE-A3(1.63±0.34)、MAGE-A6 mRNA(1.79±0.52)相对表达水平均高于对照组(1.00±0.00、1.00±0.00)(均P<0.05);观察组血MAGE-A3 mRNA表达与患者临床病理学分级和淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、绝经状态及病理类型无关(P>0.05);MAGE-A6 mRNA表达与患者淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、绝经状态、病理类型及病理学分级无关(P>0.05)。MAGE-A3 mRNA、MAGE-A6 mRNA高表达组患者的5年生存率(41.9%、44.2%)低于低表达组患者(69.1%、66.7%)(P=0.008、0.014)。结论:宫颈癌患者外周血MAGE-A3、MAGE-A6 mRNA表达异常升高,且与宫颈癌的发生发展相关,且二者高表达水平与宫颈癌患者的不良预后有关,提示临床有望成为宫颈癌临床治疗靶点和预后指标。

脑胶质瘤患者血清黑色素瘤相关抗原-A3特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫反应水平及临床意义

目的探讨脑胶质瘤组织中黑色素瘤相关抗原-A3(MAGE-A3)蛋白表达和甲基化状态,血清中特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答及临床意义。方法采用蛋白质印迹(Western blot)法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)技术检测56例脑胶质瘤组织和15例正常脑组织中MAGE-A3蛋白表达和基因甲基化状态,采用Gultured酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测患者外周血单个核细胞(PBMC)中MAGE-A3特异性CTL免疫反应,并明确二者之间的关系,以及与患者临床特征的关系。结果56例脑胶质瘤组织中MAGE-A3蛋白的表达量为(2.26±1.09),明显高于15例正常脑组织中的(0.44±0.18)(P﹤0.01)。脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化率为55.36%(31/56),明显低于正常脑组织的100%(15/15)(P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性率为33.93%(19/56),平均反应强度为(2301.70±560.33)SFC/106 PBMC。同一患者脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化状态与MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.679,P﹤0.01)。同一患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性与组织中MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.464,P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清中MAGE-A3特异性CTL免疫反应强度与组织中MAGE-A3蛋白表达量呈正相关(r=0.788,P﹤0.01)。不同肿瘤大小及临床分期的脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率比较,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子区DNA去甲基化导致MAGE-A3蛋白表达量升高,进而刺激机体产生MAGE-A3特异性CTL免疫应答反应,参与肿瘤生长和恶性进展。