辽宁丹东间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因型分析

用套式PCR方法扩增辽宁丹东地区间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP-1)基因ICB5-ICB6片段,经PvuⅡ酶切和琼脂糖凝胶电泳,对产物进行序列分析。结果显示,11份镜检确诊的间日疟患者血液标本经套式PCR扩增均出现大小约为470 bp(Sal-1型)或400 bp(Belem型)的特异性片段。经PvuⅡ内切酶消化后,其中5份血样(470 bp),出现120和350 bp酶切片段,为Sal-1型;其余6份血样(400 bp)中,1份出现400 bp片段,为Belem型,1份出现120和280 bp两种酶切片段,为重组Ⅲ型,4份出现120和240 bp两种酶切片段,为朝鲜型。辽宁省丹东地区的间日疟原虫PvMSP-1基因存在3种不同的等位基因型,以Sal-1型和朝鲜型为主,但无不同等位基因型的混合感染。

云南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1基因分型及测序

目的：确定云南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１（ Ｍ Ｓ Ｐ １）基因分型和探讨 Ｍ Ｓ Ｐ １ 基因多态性的遗传及地理特征。方法：采用巢式 Ｐ Ｃ Ｒ法和引物标记周期反应测定法，对云南疫区恶性疟原虫群体 Ｍ Ｓ Ｐ１ 基因分型，并对代表株进行基因序列分析。结果：３０ 例云南恶性疟患者，检出３８ 个基因型虫株，其中 Ｍ Ａ Ｄ２０ 型是优势虫株， Ｋ１ 次之， Ｒ Ｏ３３ 最少，并存在不同基因株混合感染现象。扩增片段序列分析表明，云南疫区的 Ｍ Ａ Ｄ２０ 型、 Ｋ１ 型和 Ｒ Ｏ３３型均分别与国际上典型的 Ｍ Ｓ Ｐ１、 Ｍ Ａ Ｄ ２０、 Ｋ１ 和 Ｒ Ｏ ３３ 等位基因代表株具有高度的同源性。结论：以 Ｍ Ｓ Ｐ１ 为基因标记物的基因分型法，有助于掌握流行区疟原虫种群的基因特点、分布及流行特征。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选(叶片切碎、在含500mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株)3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。结果构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10d后黄化或白化,再经约30d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900bp与500bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。结论获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 DNA与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答

目的探索DNA与改良痘苗病毒(MVA)组合免疫对增强恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)抗体应答的作用。方法以人工合成MSP1全基因为基础分别构建DNA免疫质粒VR1020/190和重组MVA,单用VR1020/190或与表达质粒GM-CSF共同对小鼠进行初始免疫后,用重组病毒追加强化,采用DNA/MVA组合方案免疫BALB/c小鼠,ELISA测定血清IgG及其亚类水平,经腹腔接种转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19进行攻击。结果DNA免疫能有效诱导小鼠产生抗MSP1-190抗体,其终点稀释度为1∶2500,GM-CSF质粒共免疫组抗体的终点稀释度为1∶11150,抗体亚类的测定表明GM-CSF质粒显著促进了IgG1类抗体应答,MVA追加可使单独免疫组和共免疫组抗体分别增加53和10倍;两实验组产生了水平相近的抗19000抗体(1∶32000),其含量占血清中MSP1总IgG的1/4-1/3。经转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19攻击后小鼠的存活时间并没有明显延长(P>0.05)。结论采用合成MSP1全基因进行DNA/MVA组合免疫可诱导小鼠产生显著的抗体应答,抗体的详细特性和保护作用正在进一步研究中。

间日疟原虫不同MSP-1等位基因型形态学观察

目的 比较两种不同等位基因型间日疟原虫生物学形态特征。方法 现场采集间日疟病人血样并进行基因分型 ,镜下观察形态并测量大小。结果与结论 72份现场分离株基因分型为Sal- 1型 4 0份 ,Belem型 2 5份 ,混合感染 7份 ,均查到典型的间日疟原虫 ,6例多重感染病例均发现在海南分离株 ,多重感染与基因型混合感染无关联。测量正常红细胞、寄生红细胞、环状体以及核大小差别有显著意义 ,Belem型比Sal- 1型大 。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的 为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７），本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因，并纯化及鉴定了表达蛋白。方法 将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １，形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌，纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果 成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７，转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ），纯化后纯度达７２％ ，ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论 成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白，为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７

以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段基因为基础的复合核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究

目的: 检测以恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 的17 区片段基因为基础的复合核酸疫苗VR1012/TPA/HG-MSP1-17(分泌性)和VR1012/HG-MSP1-17(非分泌性)诱导小鼠的体液免疫反应。方法: 分别用分泌性与非分泌性核酸疫苗肌注免疫小鼠。用间接ELISA法测定小鼠血清的特异性抗体。结果: 每只小鼠经3 次100 μg/100μl非分泌性核酸疫苗免疫后, BALB/c小鼠和C57BL/6 小鼠均产生明显的抗HG和抗真菌表达的MSP1 17 区蛋白(YMSP119 )抗体。但总体抗体水平不高。BALB/c小鼠经3 次200 μg/100 μl非分泌性核酸疫苗免疫后, 产生较高的抗HG抗体, 但抗MSP1-17 的抗体无明显变化。经3 次200 μg/100 μl分泌性核酸疫苗免疫后, 只产生较低的抗HG抗体。结论:

我国华南间日疟原虫裂殖子表面蛋白1等位基因分型和序列分析

目的 了解我国间日疟原虫MSP1(PvMSP1)的等位基因类型和序列的多态性。方法 用特异的引物通过套式PCR方法体外扩增包含PvMSP1的ICB5与ICB6之间的基因片段 ,并对部分扩增产物进行序列测定和分析。结果 2 7份间日疟原虫患者血样中 ,有 16份 (5 9 9% )扩增得到Belem型基因产物 ,2 5 (92 6 % )份扩增出Sal- 1型基因产物 ;两种不同等位基因型虫株的混合感染率为 5 1 9%。序列分析结果发现一个以前未见报告的基因内重组类型。结论 我国间日疟原虫虫株存在两种PvMSP1等位基因型 ,Sal- 1型可能是主导型 ;

以恶性疟原虫MSP1和AMA1疫苗组合免疫小鼠诱导保护性免疫

目的以MSP1和AMA1的DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗组合免疫小鼠,诱导针对疟疾红内期抗原MSP1和AMA1的保护性抗体。方法将编码恶性疟原虫MSP1全片段和AMA1胞外域的DNA免疫质粒(VR1020/190.3和VR1020/E)、痘苗病毒载体(rMVA/190.3和rMVA/E)及重组蛋白(d-GX190H和E)的同种类型疫苗混合,作为核酸疫苗(D)、病毒疫苗(V)及蛋白疫苗(P)按照“初始-强化”策略免疫小鼠。间接ELISA测血清中抗MSP1和AMA1抗体;用免疫血清进行体外原虫入侵红细胞抑制实验;由转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19和P.bANKA株分别对免疫鼠进行体内攻击。结果各组免疫血清中均产生了较强的抗体应答,抗MSP1抗体与抗AMA1抗体滴度的变化趋势一致。实验组免疫小鼠血清在体外对两株原虫入侵红细胞均有较大程度的抑制。体内攻击实验中实验组小鼠平均存活时间较对照组略长。结论采用以MSP1和AMA1为基础的DNA、重组痘苗病毒和重组蛋白疫苗的组合免疫小鼠能诱导出有效的保护性抗体。以上结果为疟疾红内期疫苗合理免疫方案提供了重要的实验依据。

海南省消除疟疾后期间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)多态性检测

目的比对海南省在消除疟疾前期间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的基因型。方法采用PCR扩增特异性目的片段,基因测序,序列比对及进化树构建。结果从27个本地感染间日疟样本分析来看,Sal-1型有24个,分别属于9个Sal-1亚型,为优势型。Belem型有2个,同属于1个Belem型,重组型的有1个。在各亚型中大多数仍以个别氨基酸间的替换为主,但仍发现2例新亚型以连续的氨基酸(DKKLLKEYELNADEKTKINQN)叠加个别氨基酸替换,另发现1例新型的重组型亚型。Belem型以常见19个多聚谷氨酰胺型。进化树分析可以看出,间日疟Sal-1型与Belem型及重组型可以较好的区分开,属于不同进化簇。Sal-a和Sal-b与其他亚型差距较大,独成一类,而其余亚型相对聚集性一类。Belem型本次调查中虽有2例但同属于同一亚型,为常见20个谷氨酰胺的重复,从进化树得知,该型与其他亚型同属于常见Belem型。重组型仅有一个亚型,属于为II/Q/S型重组型,但该重组型在基因库中未发现同源序列,可能属于新型的重组亚型,有待于进一步研究。结论海南消除疟疾后期(2009-2012)间日疟仍以Sal-1型为主,但仍存在该等位基因的多样性而非单一性。

恶性疟原虫裂殖子表面抗原MSA1第二区基因在大肠杆菌中的表达

目的 :在大肠杆菌中高效表达恶性疟原虫裂殖子表面抗原 MSA1- R2 ,进一步研究其生物学功能。方法 :将 MSA1- R2基因重组于 p WR4 50 I半乳糖苷酶融合蛋白表达载体中 ,转化大肠杆菌 ,酶切鉴定重组克隆。用 IPTG诱导 MSA1- R2融合蛋白的表达 ,对表达产物进行 SDS- PAGE、β-半乳糖苷酶活性、dot- ELISA和 Western- blot鉴定。结果 :表达产物占菌体总蛋白的 35%— 4 0 % ,相对分子量为 70 k Da,与半乳糖苷酶 - MSA1R2融合蛋白的理论分子量相符。IPTG诱导 4 h后 ,β-半乳糖苷酶活性可增高 10倍— 14倍 ,用 dot- EL ISA和 Western- blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。结论 :p WR4 50 -大肠杆菌表达系统可以高效表达具有免疫学活性的疟原虫蛋白。

间日疟原虫MSP-1和CSP基因遗传多样性的分析

目的比较间日疟原虫两种主要分子标志(MSP1和CSP)的遗传多样性。方法分别用MSP1和CSP基因分型方法鉴定间日疟原虫现场分离株,并进行基因多态性比较和分析。结果共检测32份海南省现场确诊的间日疟病人血样,MSP1等位基因型混合感染率为18.75%,平均克隆数1.16;CSP基因型混合感染率为35.29%,平均克隆数为1.47。如果同时考虑两种基因型,混合感染率则为50.00%。空间对应分析发现,热带族与Sal1型关系密切,PvⅡ型与重组Ⅲ型分布靠近,其他基因型则较分散。结论同时用MSP1和CSP两种分子标志检测间日疟原虫,其基因型混合感染率高于用单一标志检测,两种标志检测结果存在一定对应关系。

在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中四环素诱导表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因

目的 :用含 PL tet O启动子的 p ZE11质粒在减毒伤寒杆菌 CVD90 8疫苗株中表达恶性疟原虫 MSP1- 31片段基因。 方法 :构建受四环素诱导调控的重组质粒 p ZE11/ MSP1- 31,将该重组质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌 CVD90 8/ tet R疫苗株中 ,用免疫印迹反应检测 MSP1- 31在 CVD90 8/ tet R株中的四环素诱导表达。结果 :构建了重组的 p ZE11/ MSP1- 31质粒 ,免疫印迹反应显示该 MSP1- 31基因在 CVD90 8/ tet R株中得到有效表达 ,且依赖于四环素的存在。结论 :成功地构建了由四环素诱导的、表达恶性疟原虫 MSP1- 31的减毒伤寒杆菌疫苗株。

间日疟原虫MSP1 C端编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆间日疟原虫MSP1C端编码基因,并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSP1C端编码基因设计1对引物,采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZ1)的核酸提取物中扩增出MSP1C端编码基因,回收纯化后,与T载体连接构建重组子pMD/MSP1,并转化大肠杆菌JM109。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段,所构建的pMD/MSP1阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZ1C端基因序列与国外Sal-1株比较,碱基数相同,未发现碱基缺失,相同的核苷酸占96.7％,序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT,均编码缬氨酸),第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92.9％(34/37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较,同源性为92.5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZ1株MSP1C端编码基因,该基因在不同间日疟原虫地理株间相对保守,所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。

恶性疟原虫疫苗研究──Ⅸ．主要裂殖子表面蛋白1C端类表皮生长因子1的体外扩增及克隆

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）在其分子Ｃ－端ＭＰＳ－１１９具有两个类ＥＧＦ结构，其中类ＥＧＦ－１为特异性抗体抑制疟原虫侵入红细胞的靶位之一。本文通过酚－氯仿抽提，乙醇沉淀法提取恶性疟原虫（ＦＣＣ－１ＨＮ株）基因组ＤＮＡ，再用ＰＣＲ扩增类ＥＧＦ－１基因，经酶切纯化后插入质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经ＰＣＲ筛选及双酶切鉴定，筛选出含类ＥＧＦ－１基因的阳性克隆子。

间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达

目的 在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因 ,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST PvMSP1C。 方法 以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得间日疟原虫MSP1C端编码基因片段 ,柱纯化后 ,插入表达质粒载体的多克隆位点 ,构建重组体 pGEX 4T 2 /PvMSP1C ,并转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后 ,以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳与免疫印迹分析。 结果 双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得 1119bp的PvMSP1C编码基因片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 pGEX 4T 2 /PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致 ;SDS PAGE电泳显示 ,GST PvMSP1C融合表达蛋白的大小约 63ku ,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。 结论 成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1C端编码基因 pGEX 4T 2 /PvMSP1C表达质粒 ,诱导表达了GST PvMSP1C融合蛋白 ,表达蛋白具有一定免疫活性。

编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的17区片段的核酸疫苗诱导小鼠体液免疫反应的研究

目的初步研究编码恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）的１７区片段的核酸疫苗（ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－１７）诱导小鼠的体液免疫反应。方法ＢＡＬＢ／ｃ小鼠和Ｃ５７ＢＬ／６小鼠分别经每次每只２００μｇ／１００μｌ和１００μｇ／１００μｌ的ＶＲ１０１２／ＭＳＰ１－１７三闪肌注免疫后，用ＥＬＩＳＡ间接法检测免疫鼠血清中抗ＭＳＰ１１７区的抗体。结果两种小鼠均产生明显的抗ＭＳＰ１１７区的抗体，ＢＡＬＢ／ｃ小鼠较Ｃ５７ＢＬ／６小鼠产生的抗体略高，但总体抗体水平不是很高。结论该核酸疫苗具有一定的免疫原性。

赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫MSP-1和MSP-2基因多态性研究

目的研究赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(PfMSP-1)基因和裂殖子表面蛋白2(PfMSP-2)基因分型。方法从比奥科岛采集疟疾患者血样181份,用显微镜法和荧光定量PCR鉴定虫种。采用巢式PCR分别扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段,进行等位基因分型。结果 PfMSP-1基因分型:181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段(98.34%),其中K1、MAD20和RO33基因型片段分别为171份(94.48%)、175份(96.69%)和126份(69.61%)。混合感染率为97.24%;PfMSP-2基因分型:181份血样中有173份PfMSP-2基因片段(95.58%),其中48份(26.52%)单独扩增到3D7型基因片段,4份(2.21%)单独扩增到FC27型基因片段,混合感染率为66.85%。结论赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范围极广。混合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA1第二区基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆恶性疟原虫海南、云南、安徽３个地理株ＭＳＡ１第二区基因，测定并分析其基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株扩增片段长度为４２３ｂｐ，基因序列完全相同，我国虫株ＭＳＡ１与ＷＥＬＬＣＯＭＥ株最为相似，存在ＭＡＤ和Ｋ１两种等位基因型的基因内重组现象。

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体。方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体。以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv MSP1-19蛋白。采用亲合层析纯化重组蛋白,应用SDS-PAG电泳和Western blot对表达产物进行鉴定和分析。结果:成功构建了质粒pET28a/Pv MSP1-19,并在大肠埃希菌中诱导可溶性表达的目的蛋白。表达的蛋白能与间日疟患者血清发生特异性结合反应。结论:成功地原核表达出Pv MSP1-19目的蛋白,为间日疟的疫苗研制提供了实验基础。