番茄品种Mi基因对根结线虫抗性的检测

采用酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS）方法对国内市场上的26个番茄So-lanum lycopersicum品种进行Mi基因检测.结果表明,特璐丝、红丽、TRS-401、仙客1号和仙客5号5个品种含有纯合体Mi基因,其余品种均不含Mi基因.进一步用南方根结线虫Meloidogyne incognita和象耳豆根结线虫M.enter-olobii对这26个品种进行接种试验,计算根结率和根结指数.结果发现,南方根结线虫和象耳豆根结线虫侵染不含Mi基因的21个番茄品种的根结率为100%,根结指数为100;而含Mi基因的5个番茄品种对南方根结线虫的根结率为1%~5%,根结指数为0~4,而对象耳豆根结线虫的根结率为26.7%~45.6%,根结指数为56~64.表明含Mi基因的番茄高抗南方根结线虫,但对象耳豆根结线虫感病或比较感病.

番茄抗根结线虫Mi基因研究进展

目前国际上从番茄中发现了8个抗根结线虫基因 ,其中3个抗性基因Mi-1、Mi-3和Mi-5分别定位在番茄第6染色体和12染色体上 ,已经克隆出的Mi-1基因与其他植物抗病基因具有相似性 ,Mi基因与抗蚜虫的基因(Meu -1)密切相关 。

爪哇根结线虫Mi-毒性和无毒近等基因系的制备及其遗传变异的初步分析(英文)

爪哇根结线虫是以孤雌生殖方式繁殖的农作物重要病原物。通过将爪哇根结线虫一无毒群体在抗病番茄品种Momotaro上连续选择 19代 ,获得了一对针对抗性基因Mi的毒性和无毒近等基因系。用 10 2种引物对该近等基因系进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析显示 ,除一种引物外两者的RAPD带谱基本一致 ,证实了该毒性和无毒群体的基因组组成十分近似。对一种引物扩增出的一个无毒群体特异性的RAPD片段进行了克隆。Southern杂交结果提示该多态性片段及其同源序列在毒性选择过程中被从毒性线虫的基因组中删除。但DNA序列分析和数据库检索表明 ,该片段与迄今发表的核酸序列均不存在显著的同源性 ,因此尚无法预测其潜在的功能性。爪哇根结线虫Mi-毒性和无毒近等基因系的制备为进一步鉴定和分离该线虫毒性相关基因打下了坚实的基础。

番茄种质材料对南方根结线虫的抗性鉴定及Mi-1基因检测

采用盆栽接种2龄幼虫法,对6份番茄Solanum lycopersicum种质材料进行了对南方根结线虫Meloidogyne incognita的抗性鉴定。结果表明:供试的番茄材料对南方根结线虫的抗性存在差异,其中,高抗材料4份,抗病材料1份,感病材料1份;采用酶切扩增多态性序列(Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)方法对番茄抗性材料进行Mi-1基因检测,发现TY52、T27和Bss368 3份材料不含Mi-1基因,无限生长(红色)和T24含有Mi-1基因。

番茄育种后代Mi抗性基冈植株的筛选

根据已报道的番茄抗根结线虫病Mi基因的CAP标记设计引物,通过微量DNA提取方法提取番茄叶片的DNA.在优化DNA提取方法和PCR反应条件的基础上,对番茄育种后代共306株试材进行抗性标记筛选鉴定。其中264株无PCR扩增产物,即无抗根结线虫病基因位点,其余42株均产生了750 bp的特异片段,即具有抗根结线虫病基因的位点。利用CAP标记,经TaqI酶酶切,有3株产生了570 bp和160 bp二条特异带,为抗性纯合体;8株产生了750 bp,570 bp,160 bp三条特异带,为抗性杂合体。31株不能被TaqI酶消解,只有未消解前750 bp一条带,为感病植株。

胃腺癌细胞中miR-23a靶基因PPP2R5E的鉴定

目的利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证mi R-23a的靶基因PPP2R5E。方法选取表达绿色荧光蛋白的质粒pc DNA3/EGFP,将PPP2R5E-3’UTR的特异性序列插入其中,并与红色荧光蛋白表达质粒p Ds Red2-N1及表达mi R-23a的质粒共同稳定转染胃腺癌细胞MGC803,稳定转染后提取细胞蛋白,荧光分光光度计进行定量检测。并通过半定量RT-PCR、实时定量PCR检测mi R-23a功能受抑制或过表达mi R-23a的MGC803细胞或胃腺癌组织中PPP2R5E基因m RNA的表达情况,验证mi R-23a对其调控作用。表达si RNA抑制MGC803中PPP2R5E m RNA的表达后,通过MTT和平板克隆形成实验观察其对胃腺癌细胞系MGC803细胞活性和克隆形成能力的影响。结果绿色荧光蛋白的表达量,稳定转染pc DNA3/EGFPPPP2R5E-3’UTR质粒和mi R-23a质粒组明显低于pc DNA3/EGFP-PPP2R5E-3’UTR和pc DNA3共同稳定转染组。mi R-23a功能受抑制的胃腺癌细胞MGC803中靶基因PPP2R5E的m RNA表达水平升高;相反,过表达mi R-23a的胃腺癌细胞MGC803及胃腺癌组织中靶基因PPP2R5E的m RNA表达水平下降。沉默MGC803细胞中的PPP2R5E后,细胞活性和克隆形成能力均加强。结论 PPP2R5E可能是mi R-23a的直接靶基因。

胶质瘤中miR-410靶向作用于MET的初步研究

目的探讨mi R-410在胶质瘤细胞的作用机制。方法收集50例人胶质瘤标本以及胶质母细胞瘤U251和U87细胞系。采用mi Randa靶基因预测软件对mi R-410的靶基因预测分析,初步判断其与MET基因的相关性;利用免疫组化和原位杂交技术检测人脑胶质瘤标本中mi R-410和MET的表达;荧光素酶报告基因实验检测mi R-410对MET的靶向作用;Western blot检测mi R-410模拟物转染肿瘤细胞后MET蛋白的变化。结果经mi Randa靶基因分析:MET m RNA的3’非编码区(3’UTR)与mi R-410的种子序列存在理论上的互补匹配序列。免疫组化和原位杂交技术检测:肿瘤标本中mi R-410和MET具有负相关性(r=-0.69783,P<0.001)。荧光素酶实验进一步证实胶质母细胞瘤中MET基因是mi R-410的直接靶点。肿瘤细胞转染mi R-410模拟物后对MET蛋白的表达具有明显的抑制作用(P<0.05)。结论在胶质瘤细胞中mi R-410靶向作用MET,可能是胶质瘤治疗的新靶点。

CRISPRi在体抑制肝脏miR-122的表达

目的:探索CRISPR干扰(CRISPR interference,C R I S P R i)能否实现在体抑制肝脏m i R-122表达.方法:针对m i R-1 2 2启动子区设计sg RNA(sg T1和sg T2),并分别将其与无DNA切割活性仅保留识别活性的d Cas9-KRAB载体通过尾静脉流体力学法注射到8-10 wk龄小鼠,注射1、2、4 wk后通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)方法检测肝脏mmu-mi R-122的表达;设计不同的sg RNA浓度梯度,探索CRISPRi在体抑制肝脏mi R-122表达是否存在剂量依赖性;通过q RT-PCR及Western blot方法检测肝脏mi R-122靶分子HOMX1和Cyclin G1的表达变化.结果:在注射1 wk和2 wk后,sg T1介导的C R I S P R i在体抑制肝脏m i R-122的表达水平分别为23%(P<0.05)和16%(P<0.05);随sg RNA的剂量升高,肝脏mi R-122表达降低,当lenti Guide-Puro-sg T1质粒为120?g时,可将mi R-122的表达抑制约30%;CRIPSRi在体抑制肝脏mi R-122表达的同时,上调了mi R-122下游靶分子HMOX1和Cyclin G1的表达.结论:本研究利用CRISPRi实现了在体抑制肝脏mi R-122的表达,为抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)的在体治疗提供了新的策略.

miR-138靶向PLD2基因对口腔癌细胞增殖、迁移的影响

目的:探讨miR-138靶向PLD2基因抑制口腔癌细胞增殖、迁移的机制。方法:口腔癌细胞转染miR-138后,采用RT-PCR检测细胞中miR-138的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞转染miR-138后细胞周期的分布,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;采用Western免疫印迹实验检测胃癌细胞MMP-9、PLD2及Cyclin D1的表达水平,采用荧光素酶报告实验分析miR-138与PLD2基因的靶向关系。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果:口腔癌细胞转染miR-138后,miR-138相对表达水平为4.28±0.16,显著高于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,PLD2野生质粒荧光素酶相对活性低于其他组(P<0.05),miR-138组的PLD2的mRNA表达水平低于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。口腔癌细胞转染miR-138后,miR-373组的口腔癌细胞的增殖能力低于空白对照及miR-NC组(P<0.05)。流式细胞术实验发现,miR-138组的G0/G1期比例为(64.39±6.49)%,显著高于空白对照组及miR-NC组(P<0.05);miR-138组S期比例为(13.28±3.16)%,显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05);各组G2/M期比例差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell实验发现,口腔癌细胞转染miR-138后,迁移细胞数量为138.46±24.37,显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05)。Western免疫印迹实验发现,miR-138组MMP-9的相对水平为0.14±0.04、Vimentin的相对水平为0.17±0.02、Cyclin D1的相对水平为0.15±0.03,均显著低于空白对照组及miR-NC组(P<0.05)。结论:miR-138可靶向调控PLD2基因表达,对口腔癌的增殖、迁移能力产生抑制作用。

叶下珠水提物对HBx致肝癌细胞miRNA-21和miRNA-145异常表达的影响

目的:探讨HBx基因(简称HBx)对人肝癌Hep G2细胞mi RNA(亦称mi R或mincro RNA)-21、mi R-145表达的影响,以及叶下珠水提物对HBx和mi R-21、mi R-145异常表达的影响。方法:体外培养HBx阴性的Hep G2-CAT及稳定表达HBx的Hep G2-HBx细胞,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mi R-21、mi R-145表达的变化;分别以不同浓度叶下珠水提物(15mg/ml、7.5 mg/ml、3.75 mg/ml、0 mg/ml)处理96h后,RT-PCR检测Hep G2-HBx细胞中HBx的表达变化,以及Hep G2-CAT和Hep G2-HBx细胞中mi R-21、mi R-145的表达变化。结果:叶下珠能浓度依赖性地抑制HBx的表达(<0.05或0.01),HBx蛋白可显著上调mi R-21表达及下调mi R-145的表达水平(<0.01)。叶下珠水提物明显下调Hep G2-HBx细胞中mi R-21表达水平,且随着药物浓度的增加抑制作用显著增强(<0.01);中浓度叶下珠水提物促进Hep G2-HBx细胞中mi R-145表达(<0.01),高浓度叶下珠水提物明显提高Hep G2细胞中mi R-145的表达(<0.01)。结论:抑制HBx进而下调mi R-21及上调mi R-145表达,或直接上调mi R-145表达可能是叶下珠抗肝癌的作用机制之一。

野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建

根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。

与Mi相关的抗蚜基因的引物设计

通过NCBI等生物信息数据库搜索出与此抗蚜相关的Mi-1.1、Mi-1.2的基因组DNA序列[(Mi-1.1(CS025317 3768 bp,DNA和Mi-1.2(CS025319,3774bp,DNA)],采用Primer Premier生物信息学软件设计出Mi-1.1、Mi-1.2基因组DNA的PCR扩增引物,采用Oligo对引物进行分析,并得到:Mi-1.1的上下游引物分别是5'-AAATACTGTGGTTGCGTGAA-3'(Seq No:3347)和3'-GGGTGCTCGAAGTCTAGG-5'(Seq No:3736);Mi-1.2的上下游引物分别是5'-TAAAGTTGCGAGTGCTGT-3'(Seq No:2996)和3'-TGTTAGTAGGTCCCTCTT-5'(SeqNo:3462)。为抗蚜育种研究和PCR扩增提供条件。

mmu-miR-107调控Cacna2d1基因的mRNA水平

目的生物信息学预测并实验验证mmu-miR-107的靶基因。方法利用Target Scan、miRanda、Clip-seq及miRDB预测mmu-miR-107靶基因,分别构建含有候选靶基因(Cacna2d1、Capza2、Celsr2、Csnk1g2和Tmem47)3'UTR的荧光素酶报告载体p GL3,通过双荧光素酶检测系统、时实定量PCR进一步验证预测的靶基因。结果成功构建分别含有5个候选靶基因3'UTR的荧光素酶报告载体;与mi R-NC组相比,mi R-107组共转染p GL3-Cacna2d1 3'UTR、p GL3-Cav13'UTR的荧光素酶活性均显著下降(P<0.01或0.05);其余候选靶基因Capza2、Celsr2、Csnk1g2和Tmem47的共转染组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05);过表达或下调C2C12细胞的miR-107,可有效降低或提高Cacna2d1的mRNA水平表达(P<0.05)。结论初步验证Cacna2d1是mmu-miR-107的靶基因。

靶向Wnt1的miRNA与circRNA及其靶基因间相互作用的生物信息学分析

为对靶向Wnt1的7种mi RNAs进行circ RNAs及其靶基因的预测,同时分析其与circ RNAs及靶基因间的相互作用,分别采用Starbase及mi RWALK软件,对文献报道的靶向Wnt1基因的let-7e、mi R-21、mi R-34a、mi R-122、mi R-148a、mi R-148b与mi R-152等7种mi RNAs的circ RNAs和对应的靶基因进行生物信息学预测.利用Cytoscape 3.2.1对这7种mi RNAs和预测所得到的circ RNAs及对应的靶基因进行网络分析.并进一步对预测到的靶基因通过DAVID软件进行通路分析.Starbase软件对这7种不同mi RNAs所预测的靶circ RNAs的数量分别为58、15、41、20、28、28、28个.分别比较mi RWALK中7～9个以上软件共有的mi RNAs及其与靶基因的关系,发现CHD7基因是唯一一个在三种不同预测范围内与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b和mi R-152等4种mi RNAs相对应的靶基因.CNOT6、NBEA、ZFYVE26与ZDHHC17是在两种不同预测范围内与至少4个mi RNAs相对应的靶基因.在7种mi RNAs所预测靶基因相关的KEGG信号通路中,7～9个软件以上共有的信号通路为Focal adhesion信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路与TGF-beta信号通路.在MAPK信号通路中DUSP1与MRPS35_hsa_circ_001042均分别是与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b及mi R-152等4种mi RNAs相互作用的靶基因与circ RNA.本研究对靶向Wnt1的mi RNAs及其相互作用的circ RNAs、靶基因与信号通路等进行了网络分析与预测,为进一步分析它们之间的相互作用奠定了基础.

Mi基因家族番茄对南方根结线虫的抗性鉴定及评价

为明确Mi-1-Mi-9基因家族番茄材料对我国南方根结线虫的抗性,采用温室盆栽接种方法对37个番茄品种进行了抗性鉴定。结果明确了8个含有Mi基因的番茄材料中,7个材料对南方根结线虫表现为免疫或高抗。在抗性基因未明确的材料中,6个材料具有南方根结线虫抗性。在16个抗性未知的秘鲁番茄材料中,12个材料抗南方根结线虫。研究证实Mi基因家族番茄对我国南方根结线虫具有优良抗性,为进一步挖掘利用Mi家族基因提供了重要依据。

3种检测番茄抗根结线虫Mi基因分子标记法的比较

[目的]Mi基因是目前番茄遗传育种及生产实践中应用最为广泛的根结线虫抗源,通过对3种分子标记法检测番茄中Mi基因的结果进行比较与分析,以期为番茄抗根结线虫遗传育种提供准确、高效的分子鉴定方法。[方法]采用酶切扩增多态性序列(CAPS)、引物对组合以及序列特征扩增区(SCAR)3种分子标记法分别检测16个番茄品种的Mi基因及其基因型,同时采用人工接种法测定番茄品种对南方根结线虫的抗、感性。[结果]针对上述品种,3种分子标记法的检测结果存在着明显的差异,CAPS法检测全部供试番茄均含Mi基因,除‘线虫绝39号’外均为Mi/Mi纯合基因型;而PM3Fb/PM3Rb、PMi F3/PMiR3引物对组合检测和SCAR标记Mi23F/Mi23R检测的结果均显示有9个品种含Mi基因,前者检测表明‘VFN’‘双抗265’和‘双抗228’为Mi/Mi纯合基因型,但后者检测则显示仅‘VFN’和‘线虫绝39号’为Mi/Mi纯合基因型。接种测定结果显示:‘VFN’和‘线虫绝3号’为南方根结线虫免疫品种,‘双抗228’‘仙客1号’‘Sparta’和‘线虫绝39号’为高抗品种,‘双抗265’和‘牟番1号’为抗病品种,其余均为感病品种。[结论]CAPS法容易产生假阳性,不适用于番茄Mi基因的检测,而PM3Fb/PM3Rb、PMi F3/PMiR3的引物对组合和SCAR标记Mi23F/Mi23R这2种方法能够相对准确地检测番茄Mi基因,其中SCAR标记经单次PCR反应即可直接鉴定Mi基因的有无及其基因型,应用更为便捷。

番茄抗性基因Mi-1研究进展

Mi-1基因是重要的番茄抗病虫基因,编码蛋白质具有CC-NBS-LRR结构,抗性谱广,可有效防治根结线虫、马铃薯长管蚜和烟粉虱。综述了Mi-1抗性基因的抗虫特点,讨论了Mi-1基因的结构及其产物的抗虫类型,分析了Mi-1抗性基因对根结线虫、马铃薯长管蚜和烟粉虱的抗性功能,并进一步探讨了Mi-1基因通过突变基因和水杨酸等途径对植物病虫害的抗性机制。通过客观评价植物内源Mi-1抗性基因对植物病虫害的作用途径,明确了植物Mi-1抗性基因在农业生产中的应用价值,可为植物病虫害的生物抗性防治提供科学依据。

POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA的筛选、靶基因预测和生物信息学分析及其调控机制探讨

目的采用生物信息学方法分析术后认知功能障碍(POCD)小鼠海马组织中差异表达miRNA(DEMs)及其靶基因(DEGs),并构建POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA的调控网络图,探讨其机制。方法在GEO数据库中搜索下载POCD小鼠海马组织与正常小鼠海马组织基因表达谱芯片数据GSE95070,采用R软件lim⁃ma函数包筛选出差异表达的miRNA,即DEMs。将DEMs分别输入到miRTarBase、TargetScan、miRDB数据库中,三个数据库中皆存在的靶基因为差异表达的DEMs靶基因,即DEGs。使用R软件中的ggplot2、enrichplot函数包对DEGs进行了基因本体(GO)功能富集分析和KEGG信号通路分析。通过STRING在线工具构建DEGs蛋白互作网络(PPI),将蛋白间相互作用得分>0.4的节点输入到可视化工具Cytoscape软件中,利用cytoHubba插件筛选出节点度值排名前10的节点,即为可能参与小鼠POCD发生发展的枢纽基因。选取枢纽基因及其相应的DEMs,利用Cyto⁃scape软件构建POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA调控网络图。结果共筛选出19个显著差异表达的DEMs,得到448个DEGs。GO功能富集分析结果显示,DEGs在DNA结合的转录因子激活活性、特异性RNA聚合酶Ⅱ、微小GTP酶结合等分子功能中显著富集,在树突的形成以及调节、促进神经胶质细胞的增殖等生物学过程中显著富集,在突触膜的有机组成成分、细胞边缘以及囊泡运输等细胞组分中显著富集。KEGG信号通路分析结果显示,DEGs在Cushing综合征相关通路、cGMP-PKG信号通路、Hepatitis C信号通路、Apelin信号通路等通路中显著富集。小鼠POCD发生发展的10个枢纽基因分别为Gsk3β、Igf1、Cd34、Ubxn7、Smad2、Smarca4、Stat1、Grb2、Sin3a、Ncam1,相应的6个DEMs分别为mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p、mmu-miR-592-3p、mmu-miR-28a-3p、mmu-miR-181c-5p、mmu-miR-351-5p,成功构建了POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA-mRNA调控网络图,其中mmu-miR-362-3p调控Gsk3β的关系对、mmu-miR-3065-5p调控Igf1的关系对在调控网络中节点度最高。结论与正常小鼠海马组织相比,POCD小鼠海马组织中有19个差异表达的DEMs和448个DEGs;DEGs与树突的形成以及调节等有关,参与介导Cushing综合征相关通路、cGMP-PKG信号通路等。mmu-miR-362-3p、mmu-miR-3065-5p等差异表达的miRNA可能是通过调节Gsk3β、Igf1等靶基因的表达,影响POCD的发生发展。

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘(Citus reticulate)的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR.通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株.这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.

Huh7.5.1细胞感染HCV观察干扰素治疗后miRNA表达谱变化

目的:探寻可能对丙型肝炎病毒(HCV)有作用的mi-RNA。方法:用体外转录得到的HCV感染正常的Huh-7.5.1细胞,然后加入干扰素作用,采用mi-RNA表达谱芯片技术,分别测定Huh-7.5.1细胞正常组和HCV感染组及干扰素作用组的mi-RNA的表达,采用2(-ΔΔCT)法分析组间microRNA的表达情况。结果:以正常Huh-7.5.1细胞中表达的mi-RNA为基准,经过筛选发现13种mi-RNA在HCV感染后表达上调,而在干扰素治疗后则出现下调;另外还有7种mi-RNA则在HCV感染后出现表达下调,而在干扰素治疗后则发生上调。结论:mi-RNA10a、mi-RNA21、mi-RNA149和mi-RNA152及mi-RNA210可能与HCV的复制转录有关。