胃癌组织中miR-200a、miR-200b和miR-429的表达及临床意义

0 引言 胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，2006年中国肿瘤发病和死亡资料分析显示，无论城市还是农村，胃癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤第二位，已成为我国今后恶性肿瘤防控的重点[1]。目前，胃癌的病因尚不明确，加之滞后的临床表现和诊断，以手术为主、放化疗为辅的综合治疗手段亦未能显著提高患者的5年生存率[2]。所以，探寻胃癌新特异性的分子标志物，为其早期诊断开辟新途径具有重要意义。

miR-200b靶向DNMT3A抑制非小细胞肺癌细胞增殖与诱导凋亡

目的探讨miR-200b是否通过靶向调控DNMT3A抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖与诱导凋亡。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在不同非小细胞肺癌细胞株中的表达;将miR-200b mimics、scramble、DNMT3A-si RNA、control-siRNA分别转染于A549细胞,其中scramble与control-siRNA分别作为miR-200b mimics与DNMT3A-siRNA的阴性对照组。采用Western blot检测A549细胞中DNMT3A蛋白表达;采用MTT与AnnexinV-FITC/PI染色法分别检测A549细胞的增殖与凋亡,比较mi R-200b mimics与DNMT3A-si RNA对A549细胞增殖与凋亡的影响。结果qRT-PCR结果显示,miR-200b在非小细胞肺癌A549、H1299、L78、H460细胞中的表达均明显低于正常人支气管上皮16HBE细胞,其中以A549细胞下调最为明显(P<0.05)。Western blot结果显示,外源过表达mi R-200b或沉默DNMT3A能明显下调A549细胞中DNMT3A蛋白的水平。MTT结果显示,转染mi R-200b mimics或沉默DN-MT3A 48h、72h、96h后,反映细胞增殖的光密度(OD)值与各自阴性对照组比较明显减小(P<0.05)。AnnexinV-FITC/PI染色结果显示,转染miR-200b mimics或沉默DNMT3A后,A549细胞的凋亡率分别为(23.33%±0.90%、20.41%±0.70%)均高于各自阴性对照组(5.28%±0.55%、5.68%±0.47%,P<0.05)。结论miR-200b通过下调DNMT3A抑制人非小细胞肺癌细胞增殖与诱导凋亡。

miR-200b对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的负性调控作用

目的研究miRNA-200b对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法定量PCR检测人乳腺癌细胞株MCF-7、BT-474、MDA-MB-453、SKBR3、MDA-MB-468、MDA-MB-231中miRNA-200a/b/c的表达情况,通过miR-200b抑制剂及拟似物分别抑制、促进miR-200b的表达后,观察癌细胞增殖能力、克隆形成及侵袭能力的变化。结果 miRNA-200家族在Luminal型乳腺癌细胞MCF-7、BT-474和Her-2表达型MDA-MB-453、SKBR3的表达量高于三阴性型MDA-MB-468、MDA-MB-231的表达。通过inhibitor、mimics分别抑制、促进MDA-MB-231细胞中miR-200b的表达后,结果显示miR-200b对肿瘤细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),miRNA-200b组对肿瘤细胞的克隆形成有抑制作用(P<0.05),对癌细胞侵袭有抑制作用(P<0.05)。结论miRNA-200b对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231具有负性调控作用,可以作为潜在的早期诊断及治疗靶点。

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

目的探讨miR-200b是否通过靶向调控血管内皮生长因子(VEGF)抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭,以揭示miR-200b的抑瘤机制。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达;将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组,分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞;采用Western blot检测A549细胞中VEGF蛋白表达,采用Transwell侵袭实验分别检测A549细胞侵袭能力。结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-200b在A549、16HBE细胞的表达分别为0.704±0.053、1.582±0.071,两者比较,差异有显著性(P<0.01);Western blot结果显示,外源过表达miR-200b或沉默VEGF能明显下调A549细胞中VEGF蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验显示,转染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(127±6)和(136±8),与对照组(189±14)比较能明显抑制A549细胞的穿膜能力(P<0.05),而转染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。结论 miR-200b通过靶向调控VEGF抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭。

miR-200b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响以及对Bcl-2表达的调节

目的:研究miR-200b对胃癌MGC-803细胞Bcl-2蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-200b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响.方法:用人工合成的miR-200b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelectTM pEGP-miR载体,经测序鉴定后作为microRNA的表达质粒;用脂质体将miR-200b高表达质粒转染进MGC-803胃癌细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆.构建Bcl-2高表达质粒,转染入MGC-803胃癌细胞和含有miR-200b高表达质粒的MGC-803细胞中.用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测Bcl-2的mRNA和蛋白表达;用MTT法检测胃癌MGC-803细胞增殖的变化.结果:Western blot结果显示,与正常MGC-803细胞相比,转染了miR-200b的胃癌MGC-803细胞中,Bcl-2蛋白的表达降低了56.91%,RT-PCR分析显示Bcl-2mRNA表达降低了32.29%;MTT结果显示转染了miR-200b的细胞增殖受到显著抑制.进一步的实验结果显示,转染了Bcl-2高表达质粒的胃癌细胞增殖受到促进,48h最明显增加了16.82%,然而转染了miR-200b和Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞增殖却下降了7.97%;Western blot结果显示,与转染了pCMV6-XL5-Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞组相比,转染了pEGP-miR-200b高表达质粒的MGC-803细胞中Bcl-2蛋白的表达降低了4.84倍,而转染了pEGP-miR-200b和pCMV6-XL5-Bcl-2高表达质粒的MGC-803细胞中Bcl-2蛋白的表达量降低了1.76倍.结论:过表达的miR-200b抑制MGC-803胃癌细胞增殖,这种抑制作用至少部分与Bcl-2基因的低表达有关.

急性缺血性脑卒中病人血清miR-7和miR-200b表达水平及与脑侧支循环分级的关系探讨

目的检测急性缺血性脑卒中(CIS)病人血清miR-7和miR-200b表达水平,探讨二者对CIS病人脑侧支循环途径的预测价值。方法选择2016年5月—2018年5月在我院神经内科住院治疗的126例CIS病人为研究对象,根据脑侧支循环的建立情况分为一级侧支循环组(44例)、二级侧支循环组(63例)和三级侧支循环组(19例),同期选取健康体检者50名作为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测受试者血清miR-7、miR-200b水平,并进行分析。结果与对照组比较,CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。检测血清miR-7、miR-200b水平诊断CIS疾病的ROC曲线下面积(AUC)分别为:0.734、0.667,灵敏度分别为63.41%、57.89%,特异度分别为75.70%、74.61%。miR-7、miR-200b表达水平与CIS病人脑侧支循环分级和美国介入和治疗神经放射学会/介入放射学会(ASITN/SIR)血流分级有关(P<0.05)。miR-7、miR-200b水平预测CIS病人建立三级侧支循环途径的AUC分别为0.894、0.876,灵敏度分别为79.82%、71.90%,特异度分别为86.91%、84.73%。结论CIS病人血清miR-7、miR-200b低表达,且在脑侧支循环分级不同的病人存在明显差异,检测血清miR-7、miR-200b水平对CIS病人脑侧支循环途径的预测具有一定价值。

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织(肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢)中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织(肝脏、肠、脾脏和头肾)中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(poly I:C)4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。

miR-200b调控肌球蛋白轻链激酶／磷酸化肌球蛋白轻链信号通路对肠上皮紧密连接的影响

目的探究mi R-200b对肠上皮紧密连接的影响及作用机制。方法利用阴性对照慢病毒及表达mi R-200b的慢病毒感染Caco-2细胞形成NC株和200b株,以10 ng/m L肿瘤坏死因子(TNF-α)处理建立体外肠上皮损伤模型,并分为NC组、NC+TNF-α组、200b组和200b+TNF-α组。测量4组细胞对肠上皮跨膜电阻抗(TEER)及对异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的通透性;Western blot检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)表达。结果与NC组相比,NC+TNF-α组TEER值降低、对FITC-dextran通透量显著增高、MLCK和P-MLC表达上调,差异均有统计学意义(P?<0.05)。与NC+TNF-α组相比,200b+TNF-α组TEER显著升高、FITC-dextran通透量显著降低、MLCK和P-MLC表达显著下调,差异均有统计学意义(P?<0.05)。结论 mi R-200b可调控MLCK/P-MLC信号通路修复TNF-α导致的肠上皮紧密连接损伤。

MiR-200b通过调控PIK3CA/AKT通路抑制大鼠角膜血管新生

目的探讨microRNA-200b(miR-200b)在大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)形成中的作用及其调节机制。方法24只雌性SD大鼠采用一眼经缝线法构建CNV模型(实验组),另一眼作为正常对照组,于裂隙灯下观察建模后第4、7、14天角膜新生血管情况,采用HE染色观察角膜组织结构改变及炎性细胞浸润情况,RT-PCR检测造模后第14天各组大鼠角膜组织中miR-200b以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达。利用脂质体转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),分为miR-200b模拟物(miR-200b mimic)组、阴性对照(miR-NC)组、空白对照(CON)组,利用RT-PCR验证转染效果,分别采用CCK-8检测HUVECs增殖能力,划痕实验检测HUVECs迁移能力,Matrigel胶成管实验检测HUVECs管腔形成能力。并通过Western blot检测VEGF及PIK3CA、AKT蛋白的表达。结果成功构建大鼠CNV模型,HE染色显示与正常组相比,缝线后第4、7、14天,大鼠角膜组织排列紊乱,炎性细胞浸润逐渐加重(P<0.05),RT-PCR结果显示缝线后第14天角膜组织中miR-200b表达明显降低,而VEGF表达明显升高(P<0.01)。与CON组和miR-NC组相比,miR-200b mimic组中miR-200b相对表达量显著升高(P<0.01),而增殖、迁移及管腔形成能力显著下降(P<0.05),转染miR-200b mimic后,HUVECs中VEGF、PIK3CA、p-AKT蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论miRNA-200b可显著抑制HUVECs的增殖、迁移及成管能力,可能通过抑制PIK3CA/AKT通路参与CNV的发生和发展。

miR-200b介导血肿瘤屏障通透性增加的机制

目的:研究微小RNA(microRNA,miRNA)miR-200b是否介导血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)通透性增加。方法:测量跨内皮阻抗值(TEER)、辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量,分析血脑屏障(bloodbrain barrier,BBB)和BTB通透性的改变,应用Real-time PCR检测血脑屏障BBB和BTB大鼠脑微血管内皮细胞(rat cerebral microvascular endothelial cell RCMEC,ECs)miR-200b的表达,应用miR-200b agomir和miR-200b antagomir分别转染GECs(ECs和U87脑胶质瘤细胞共培养的细胞)后分析血肿瘤屏障的通透性改变;应用Western blot检测紧密连接相关蛋白ZO-1(zonula occludens-1)的表达;应用免疫荧光方法观察GECs紧密连接相关蛋白ZO-1和丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)结构和分布的改变。结果:与BBB相比,BTB的TEER值显著降低,HRP显著升高;与BBB的ECs相比,GECs内源性miR-200b表达显著降低;miR-200b agomir和miR-200b antagomir成功转染到GECs中;miR-200b agomir组TEER值显著升高,HRP流量显著降低,以及ZO-1表达显著升高,抑制ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,抑制丝状肌动蛋白由细胞膜边缘向细胞中央区分布,F-actin分布于细胞边缘明显增加,应力纤维形成明显减少;miR-200b antagomir结果与miR-200b agomir实验结果相反。结论:MiR-200b介导BTB通透性增加。

miR-200b靶向MAP2对缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响

目的研究miR-200b对缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响及潜在机制。方法将大鼠皮质神经细胞分为正常对照组(不做处理),缺氧缺糖模型组(含0.5 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle.s液培养48 h),anti-miR-NC组、anti-miR-200b组、miR-NC组和miR-200b组,qRT-PCR检测细胞中miR-200b、calpain1 m RNA和MAP2 mRNA的含量,Western blot测定MAP2、calpain1、凋亡相关蛋白pro-caspase3和cl-caspase3的水平,CCK8法和流式细胞术分别检测细胞存活率和凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-200b与MAP2的靶向关系。结果与对照组相比,缺氧缺糖模型组大鼠皮质神经元细胞中miR-200b和calpain1 mRNA水平均升高(P<0.05),MAP2 mRNA水平降低(P<0.05),细胞存活率降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);在缺氧缺糖模型组大鼠皮质神经元细胞中抑制miR-200b可提高细胞存活率(P<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.05),提高pro-caspase3、MAP2mRNA和蛋白含量(P<0.05),降低cl-caspase3、calpain1 mRNA和蛋白含量(P<0.05),过表达miR-200b则结果相反;双荧光素酶报告实验结果表明,MAP2是miR-200b的靶点。结论miR-200b可能靶向MAP2调控缺氧缺糖诱导的大鼠皮质神经细胞损伤和凋亡。

miR-200b调控PDCD4的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨miR-200b对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其可能的分子机制。方法利用荧光实时定量PCR检测人乳腺癌组织及乳腺癌细胞株中miR-200b的表达差异;利用生物信息学方法预测miR-200b的靶基因,并使用免疫蛋白印迹实验对靶基因的表达进行验证;分别将miR-200b siRNA、PDCD4 mimics以及相应对照miRNA转染MCF-7细胞,通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力;采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果miR-200b在乳腺癌组织中呈低表达水平,进一步抑制miR-200b的表达,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力显著增强(P<0.05);将miR-200b siRNA、PDCD43′-UTR共转染到乳腺癌MCF-7细胞中,双荧光素酶报告基因结果显示抑制miR-200b的表达后,PDCD4的表达及活性相应上调(P<0.05);同时通过蛋白免疫印迹实验可以发现,抑制miR-200b表达后,PDCD4蛋白表达含量降低,乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显增强(P<0.05);而过表达PDCD4后PDCD4蛋白表达含量增加(P<0.05),乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力明显降低(P<0.05)。结论miR-200b可靶向上调PDCD4基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力。

miR-200b-3p/NBR1轴对乳腺癌细胞自噬及生长的影响

目的miR-200b-3P靶向NBR1调控乳腺癌自噬的作用仍未完全探索,文章旨在探讨miR-200b-3p是否靶向NBR1影响乳腺癌细胞自噬及生长。方法介绍些分组选择人乳腺癌细胞(MDA-MB-453)为研究对象,分为阴性对照组(转染mimic NC或inhibitor NC)、miR-20Ob-3p mimic组(转染miR-200b-3p模拟物)、miR-200b-3p inhibitor组(转染miR-200b-3p抑制剂),采用CCK-8法和克隆形成实验检测各组细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Tmnswell实验检测细胞侵袭能力;透射电镜观察细胞超微结构;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-200b-3p mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测Beclin-1、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ、NBR1蛋白表达;双荧光素酶报告实验验证miR-200b-3p与NBR1之间的靶向关系。结果qRT-PCR检测结果显示,与mimic NC组(1.000±0.069)比较,miR-200b-3p mimic组miR-200b-3p mRNA表达(1.314±0.093)明显升高;与inhibitor NC组(1.009±0.055)比较,miR-200b-3p inhibitor组miR-200b-3p mRNA表达(0.581±0.031)明显降低(P<0.05);与miR-200b-3p mimic组比较,miR-200b-3p inhibitor组miR-200b-3p mRNA表达明显降低(P<0.05)。细胞侵袭结果显示,与mimic NC组比较,miR-200b-3p mimic组穿过基膜的细胞数明显降低(P<0.01),与inhibitor NC组比较,miR-200b-3p in-hibitor组穿过基膜的细胞数明显升高(P<0.0l),与miR-200b-3p mimic组比较,miR-200b-3p inhibitor组穿过基膜的细胞数明显升高(P<0.05)。细胞周期阻滞结果显示,与mimic NC组比较,miR-200h-3p mimic组细胞在G2/M期、S期均明显减少,G1/G0期细胞均明显增多,与inhibitor NC组比较,miR-200b-3p inhihitor组细胞在G2/M期、S期均明显增多(P<0.05),G1/G0期细胞均明显减少(P<0.05)。Western blot法检测结果显示,与mimic NC组比较,miR-200b-3p mimic组细胞中Beclin-1、LC3II/I蛋白水平明显升高,P62蛋白表达明显降低(P<0.01),与inhibitor NC组比较,miR-20Ob-3p inhibitor组细胞中Beclin-1、LC3II/I蛋白水平明显降低,P62蛋白表达明显升高(P<0.01)。Weatem blot检测结果显示NBR1蛋白表达于转染miR-200b-3p mimic后明显降低,转染miR-200b-3p inhibitor后明显升高(P<0.01)。结论miR-200b-3p mimic可能通过靶向NBR1表达抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖、侵袭,促进细胞凋亡及自噬。

miR-200b、miR-200c靶向肝细胞生长因子抑制结直肠癌细胞

目的研究miR-200b、miR-200c对肝细胞生长因子进行靶向调节抑制结直肠癌细胞增殖的机制。方法采用生物信息学软件预测和验证miR-200b、miR-200c靶基因,分析miR-200b、miR-200c过表达抑制HGF表达,并分析miR-200b、miR-200c在体外影响结直肠癌细胞增殖活性的情况。结果培养1d、2d、3d,阴性对照模拟物的结直肠癌细胞增殖活性均高于miR-200b模拟物、miR-200c模拟物、miR-200b/c模拟物(P<0.05),阴性对照抑制剂的结直肠癌细胞增殖活性均低于miR-200b抑制剂、miR-200c抑制剂、miR-200b/c抑制剂(P<0.05),miR-200b模拟物、miR-200c模拟物的结直肠癌细胞增殖活性均高于miR-200b/c模拟物(P<0.05),miR-200b抑制剂、miR-200c抑制剂的结直肠癌细胞增殖活性均低于miR-200b/c抑制剂(P<0.05)。结论miR-200b、miR-200c对肝细胞生长因子进行靶向调节抑制结直肠癌细胞增殖,可以作为潜在治疗靶点。

miR-200b与癌胚抗原在大肠癌中的表达及其相关性

目的探讨miR-200b与癌胚抗原(CEA)在大肠癌发生、发展中的表达情况及其表达的相关性。方法采用实时荧光定量PCR方法分析60例大肠癌组织及正常组织中miR-200bmRNA和CEA mRNA表达结果,分析其与患者临床资料、病理参数之间的关系,研究大肠癌组织中miR-200bmRNA和CEA mRNA表达的相关性。结果大肠癌组织中miR-200bmRNA的表达显著低于正常组织,CEA mRNA显著高于正常组织,差异均有统计学意义(P<0.01);患者性别、年龄及肿瘤部位的miR-200bmRNA和CEA mRNA表达结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同组织学分级及TNM分期中,CEA呈现过表达状态,而miR-200b呈现表达降低或缺失状态;大肠癌组织中miR-200b和CEA的表达具有相关性,且呈负相关关系(r=-0.790,P<0.001)。结论 miR-200b在大肠癌组织中呈低表达或表达缺失,与CEA的表达呈一定的负相关关系,提示miR-200b可为肿瘤的诊断和治疗提供新的依据。

miR-200b通过靶向调控Ets-1对白介素-1β诱导胰岛β细胞损伤的保护作用

目的探讨miR-200b靶向Ets-1对白介素(IL)-1β诱导胰岛β细胞损伤的保护作用。结果体外培养大鼠胰岛β细胞株RINm5F,采用IL-1β诱导RINm5F细胞损伤,将RIN-m5F细胞分为对照组、损伤组(0.5 ng/ml IL-1β)、空转染组(0.5 ng/ml IL-1β+空载体)和过表达组(0.5 ng/ml IL-1β转染+miR-200b mimics),采用qRT-PCR检测转染48 h各组的miR-200b和Ets-1 mRNA水平,采用MTT法、FITC-Annexin V/PI双染流式细胞术及酶联免疫吸附法检测各组转染12、24、48及72 h的细胞存活率、凋亡率及胰岛素水平,检测各组细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、丙二醛(MDA)水平、总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比,损伤组、空转染组的miR-200b水平降低,Ets-1 mRNA水平升高,但过表达组的miR-200b水平升高,Ets-1 mRNA水平降低(P<0.05)。损伤组、空转染组转染后的存活率、上清液胰岛素水平及GSH-Px、T-AOC和SOD活性低于对照组,MDA水平和凋亡率高于对照组(P<0.05);过表达组的以上指标均优于对照组(P<0.05),但与对照组均有统计学差异(P<0.05)。结论上调miR-200b水平对IL-1β诱导胰岛β细胞损伤有保护作用,主要表现在提高细胞存活、促进胰岛素分泌及改善氧化应激,可能与其靶向作用Ets-1有关。

二烯丙基二硫对非小细胞肺癌细胞miR-200b表达的影响及意义

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人非小细胞肺癌A549(A549细胞)miR-200b表达的影响及意义。方法常规培养A549细胞、人支气管上皮16HBE细胞,连续培养48 h时采用RT-PCR法检测miR-200b相对表达量;将A549细胞分别与终浓度为0、25、50、100、200、400μmol/L的DADS共培养,连续培养48 h时采用RT-PCR法检测miR-200b相对表达量。将常规培养的A549细胞随机分为五组,scramble组转染miR-200b无关序列,miR-200b组转染miR-200b模拟物,空白组仅加培养液常规培养,DADS组加入200μmol/L DADS处理,DADS+miR-200b组转染miR-200b模拟物的同时加入200μmol/L DADS处理,各组均连续培养48 h时,采用MTT法检测细胞增殖情况(OD值)。结果 16HBE细胞miR-200b相对表达量为1.364±0.031,高于A549细胞的0.673±0.023(P<0.05);0、25、50、100、200、400μmol/L DADS处理A549细胞48 h时miR-200b相对表达量分别为0.673±0.023、0.752±0.019、0.805±0.011、1.041±0.049、1.176±0.046、1.342±0.051,各浓度间比较P均<0.05。scramble组、miR-200b组、空白组、DADS组、DADS+miR-200b组OD值分别为0.740±0.027、0.552±0.024、0.735±0.021、0.561±0.027、0.462±0.026,miR-200b组、DADS组、DADS+miR-200b组OD值均低于scramble组及空白组,DADS+miR-200b组均低于DADS组及miR-200b组,组间比较P均<0.05。结论 DADS能够上调A549细胞miR-200b表达,进而抑制细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。

VEGF逆转miR-200b促进非小细胞肺癌增殖的作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在miR-200b抑制非小细胞肺癌(NSCLC)增殖中的作用及机制。方法选择2013年2月至2014年5月在本院经手术治疗的65例NSCLC患者的肿瘤组织,qRT-PCR检测NSCLC组织中miR-200b与VEGF的表达,并统计分析NSCLC组织中miR-200b与VEGF表达的相关性;常规培养A549、H460及16HBE细胞,qRT-PCR检测各组细胞中miR-200b与VEGF的表达;将常规培养的A549细胞随机分为四组,即miR-200b mimics+vector、miR-200b mimics+VEGF组、miR-200b inhibitor+scramble组、miR-200b inhibitor+VEGF-si RNA组,其中miR-200b mimics+vector组与miR-200b inhibitor+scramble组作为阴性对照,采用MTT法检测各组吸光度值(OD值)。结果 qRT-PCR结果显示,miR-200b在NSCLC组织的表达水平为(0.682±0.106),VEGF在NSCLC组织的表达水平为(2.731±0.597),相关性分析显示在NSCLC组织中miR-200b与VEGF的表达呈负相关(r=-0.514,P<0.001);miR-200b在A549、H460细胞中的表达显著低于16HBE细胞,差异有统计学意义(P=0.000),而VEGF在A549、H460细胞中的表达明显高于16HBE细胞,差异有统计学意义(P=0.000);MTT结果显示,miR-200b mimics+VEGF组A549细胞在48 h、72 h的细胞增殖率明显高于miR-200b mimics+vector组,miR-200b inhibitor+VEGF-si RNA组A549细胞在48 h、72 h的细胞增殖率明显低于miR-200b inhibitor+scramble组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-200b与VEGF在NSCLC组织及细胞中表达呈负相关;VEGF逆转miR-200b对NSCLC细胞增殖的作用。

DADS上调miR-200b抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭

目的探索miR-200b和二烯丙基二硫(DADS)相关的抑瘤机制,为揭示DADS抑制视网膜母细胞瘤生长及侵袭的内在分子机制提供理论依据。方法采用q RT-PCR分别检测不同浓度的DADS对Y79细胞miR-200b表达的影响,DADS分别设置六种浓度:0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L。MTT和Transwell侵袭实验分别检测DADS和miR-200b对Y79细胞生长及侵袭能力的影响,将实验设置成五个组,即miRNA阴性对照组(瞬时转染scramble 40μmol/L);miR-200b组(瞬时转染miR-200b-mimics 40μmol/L);DADS阴性对照组(DMSO 10μmol/L,即mock组);DADS组(DADS 200μmol/L)和DADS+miR-200b组(瞬时共转染miR-200b-mimics 40μmol/L)和DADS(200μmol/L)。结果 DADS可上调Y79细胞中miR-200b的表达,且其呈剂量依赖性(P<0.05);在MTT实验中,miR-200b组的OD值(0.549±0.057)较miRNA阴性对照组(0.737±0.135)明显降低;DADS组的OD值(0.508±0.064)较DADS阴性对照组(0.722±0.145)明显降低;而DADS+miR-200b组的OD值(0.362±0.081)较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组降低最为显著(P<0.05),即DADS可以通过上调miR-200b抑制Y79细胞的增殖能力。在Transwell侵袭实验中,外源性的高表达miR-200b组(105±13)较miRNA阴性对照组(162±12)能够显著抑制Y79细胞的穿膜细胞数,DADS组(102±13)较DADS阴性对照组(154±8)能够显著降低Y79的穿膜细胞数,且DADS+miR-200b组(77±8),细胞穿膜细胞数较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组减少最显著(P<0.05),即DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞侵袭。结论 DADS通过上调miR-200b的表达抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长及侵袭。

miR-200b通过靶向CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的研究hsa-miR-200b对人U251胶质瘤细胞增殖的影响及相关作用机制。方法将miR-200b过表达和表达沉默质粒分别稳定转染至胶质瘤U251细胞,qRT-PCR验证转染效率,CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化,qRTPCR以及Western blot方法检测的CRKL的m RNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点。将CRKL过表达和表达沉默质粒载体分别稳定转染至U251胶质瘤细胞,使用CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化。分别建立miR-200b和CRKL的稳定双转染U251细胞系,使用CCK-8法检测对各组细胞增殖水平的变化。结果与对照组相比,miR-200b过表达显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖并且抑制CRKL在U251胶质瘤细胞的m RNA和蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证了miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点;CRKL过表达显著增强胶质瘤U251细胞增殖能力;CRKL过表达有效阻断了miR-200b抑制胶质瘤U251细胞增殖的作用。结论 miR-200b能够通过靶向下调CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖。