肠艾美耳球虫重组微线蛋白2对家兔免疫保护效果评价

本研究旨在评价肠艾美耳球虫重组微线蛋白2(rEiMIC2)对兔的免疫保护效果,为肠艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研究提供参考。在肠艾美耳球虫转录组数据中筛选出EiMIC2基因,进行克隆、原核表达和蛋白纯化,并采用免疫印迹检测重组蛋白的免疫反应性。将35日龄无球虫新西兰幼兔32只随机分为4组(未免疫未攻虫组、未免疫攻虫组、pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组),每组8只,未免疫未攻虫组和未免疫攻虫组每只颈部皮下注射1 mL无菌PBS,pET-32a(+)载体组和rEiMIC2免疫组每只分别接种100μg pET-32a(+)载体蛋白、rEiMIC2,首免后2周进行二免。二免14 d后,除去未免疫未攻虫组,其余3组每只新西兰兔口服接种5×10^(4)个肠艾美耳球虫孢子化卵囊;攻虫14 d后安乐死所有新西兰兔。重组蛋白免疫兔后通过观察临床症状、肠道病变、测定兔的相对增重率、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)值和料肉比以及检测血清中特异性IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ综合评价rEiMIC2的免疫保护效果。结果显示,EiMIC2基因开放阅读框长度为1 605 bp,编码的蛋白分子质量约为57.68 ku。免疫印迹显示rEiMIC2能够被阳性血清所识别,表明其具有良好的免疫反应性。免疫保护试验显示:攻虫后各组幼兔陆续出现精神沉郁和腹泻的症状,未免疫攻虫组和rEiMIC2免疫组各有1只兔死亡;rEiMIC2免疫组相对增重率为73.97%,卵囊减少率为69.98%,ACI值为136.97,料肉比为3.98∶1,与未免疫攻虫组差异显著(P<0.05);rEiMIC2免疫组肠道病变与未免疫攻虫组相比较轻,血清中特异性IgG水平显著高于未免疫攻虫组(P<0.05)。综上,rEiMIC2免疫兔后,能有效减少卵囊排出和增重损失,减轻肠道损伤,具有一定的保护效果。

刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定

目的确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W767)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2CW/A突变体基因片段;构建MIC2CW/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2CW/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白(对照蛋白)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2CW/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2CW/A突变体蛋白;GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带,而且可以被醛缩酶抗体识别,而GST-MIC2CW/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论将MIC2的W767突变为A后,MIC2失去与醛缩酶的作用,即MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸(W)。

鸡球虫微线基团Etmic-2的一种蛋白异形体的发现

本文利用PCR技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子和孢子化卵囊基因组DNA中扩增出微线蛋白EtMIC 2基因序列 ,并进行了克隆和核苷酸序列测定。核苷酸序列表明Etmic 2基因包含有二种cDNA序列 ,并含有 3个内含子 ,每一个内含子都有真核生物内含子典型剪切共有序列 (GT/AG)。与二种cDNA序列比较发现 ,Etmic 2基因的 pre mRNA可以通过内含子的 3’端的不同剪切位点而产生不同的mRNA ,生成至少两种蛋白异形体。本文从基因序列上解释了EtMIC 2蛋白的二种蛋白异形体产生过程。

基于p38MAPK/SERCA2α通路观察羟基红花黄色素A对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

目的:基于p38丝裂原活化蛋白激酶/肌质网Ca^(2+)-ATP酶2α(p38MAPK/SERCA2α)通路观察羟基红花黄色素A(HSYA)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法:120只SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、HSYA 5 mg/kg组、HSYA 10 mg/kg组、HSYA 20 mg/kg组及p38MAPK信号通路抑制剂组(SB203580组)。5、10、20 mg/kg HSYA组大鼠分别灌胃给予对应剂量HSYA,SB203580组给予100µg/kg SB203580,末次灌胃结束后制作MIRI模型,Sham组仅切开左胸暴露心脏不结扎。缺氧4 h、复氧12 h建立H9C2心肌细胞OGD/R损伤模型并分为6组:对照组(Control组)、缺氧复氧模型组(OGD/R组)、5、10、20µmol/L HSYA组及SB203580组,Control组、OGD/R组不进行药物干预。TTC染色测定大鼠心肌梗死面积;超声心动图检测大鼠心脏功能;HE染色观察大鼠心肌组织病理学改变;Annexin V-FITC/PI双染法检测大鼠心肌组织和H9C2细胞凋亡;检测大鼠血清氧化应激及心肌酶指标;ELISA检测大鼠心肌组织和H9C2细胞炎症因子含量;CCK8及EdU染色检测H9C2细胞增殖能力;qRT-PCR检测心肌组织和H9C2细胞p38MAPK、SERCA2αmRNA表达;Western blot检测大鼠心肌组织和H9C2细胞p38MAPK、p-p38MAPK、SERCA2α、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达。结果:10µmol/L或10 mg/kg HSYA能够提高左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、Bcl-2、SERCA2α水平,降低肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低Bax、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、丙二醛(MDA)、TNF-α、IL-1β、IL-6、p-p38MAPK/p38MAPK水平,促进心肌细胞增殖,抑制细胞凋亡,减少心肌梗死面积,改善心肌损伤。结论:HSYA能够抑制心肌细胞凋亡、氧化应激及炎症,从而减轻MIRI,其机制可能与p38MAPK/SERCA2α信号通路有关。

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统展示柔嫩艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活载体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT-PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到酿酒酵母表面展示的载体pCTCON2,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酿酒酵母菌株EBY100,诱导表达后,用抗EtMIC2蛋白质特异性抗体,做间接免疫荧光(IFA)检测EtMIC2蛋白的表达。结果显示,EtMIC2成功展示到酵母细胞表面,测得最佳诱导时间为48h。

弓形虫MIC2胞质尾段蛋白及其多克隆抗体的制备

目的:制备弓形虫微线体蛋白2胞质尾段(MIC2C)蛋白片段及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA文库为模板,PCR扩增135bp MIC2C基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC2C融合蛋白;用纯化的融合蛋白加免疫佐剂背部皮内注射免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了MIC2C原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC2C融合蛋白,蛋白的浓度为3.07mg/ml;获得了抗该蛋白的兔源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1:16 000。结论:在体外制备并纯化了GST-MIC2C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续弓形虫入侵机制的研究奠定了基础。

刚地弓形虫MIC2突变体的构建及其特性分析

目的利用基因定点突变的方法将刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)的767位氨基酸的碱基定点突变,蛋白相互作用技术分析突变体的特性。方法利用基因定点突变的方法,将MIC2蛋白羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(tryptophan,W)的碱基突变为丙氨酸(alanine,A)的碱基,PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段;构建MIC2C W/A/p GEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。以该蛋白和MIC2C蛋白(未突变蛋白)为探针蛋白与弓形虫裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果获得了MIC2C W/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白;GST pull-down实验产物分析显示GST-MIC2C W/A蛋白的产物中未见蛋白条带,而未突变蛋白的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别。结论在体外获得了MIC2突变体;MIC2突变体不能沉降弓形虫裂解液中的醛缩酶,即MIC2突变体失去了与醛缩酶作用的特性。

大肠癌细胞侵袭转移的PKC调节机制研究

目的 探讨蛋白激酶C(PKC)对大肠癌细胞侵袭转移的调节机制。方法 采用羊膜侵袭培养系统和明胶酶谱分析的方法 ,研究PKC激活剂佛波酯PMA ,对人大肠癌细胞株HT 2 9体外侵袭作用的影响及PKC抑制剂staurosporine(SP)对PMA的拮抗作用 ,研究这种体外的侵袭作用与细胞分泌 72kD的基质金属蛋白酶MMP 2和 92kD的基质金属蛋白酶MMP 9的关系。结果 PMA可显著增强HT 2 9细胞的侵袭性 ,与对照组相比 ,有显著性差异 (P <0 .0 1) ,而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用。PMA还可增加HT 2 9细胞分泌MMP 2和MMP 9,而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用 ,抑制MMP 2和MMP 9的分泌。结论 PKC可调节大肠癌细胞侵袭转移 ,PKC的激活可诱导大肠癌细胞侵袭性增强和增加MMP 2和MMP 9的分泌 ,PKC的抑制可促进大肠癌细胞侵袭性降低和减少MMP 2和MMP 9的分泌。MMP 2和MMP 9的分泌与肿瘤细胞侵袭性有密切关系 ,PKC可能通过调节MMP 2、MMP

蛋白激酶C对大肠癌细胞转移特性调控的实验研究

目的:探讨蛋白激酶C(protein kinase C.PKC)对大肠癌细胞转移特性的调控作用。方法:采用羊膜侵袭培养系统和明胶酶谱分析的方法,研究了PKC激活剂PMA对人结肠癌细胞株HT-29体外侵袭作用的影响及PKC抑制剂Staurosporine(sP)对PMA的拮抗作用,以及研究了这种体外的侵袭作用与细胞分泌Ⅳ型胶原酶,包括72kDⅣ型胶原酶(MMP-2)和92kDⅣ型胶原酶(MMP-9)的关系。结果:PMA可显著增强HT-29细胞的侵袭性,与对照组相比,具有显著性差异(P<0.01).而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用。PMA还可增加HT-29细胞分泌MMP-2和MMP-9,而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用,抑制MMP-2和MMP-9的分泌。结论:蛋白激酶C可能是调控肿瘤细胞侵袭、转移的重要因素。PKC的激活可诱导肿瘤细胞侵袭性增强和分泌MMP-2和MMP-9增加,SP可能通过抑制PMA对PKC的激活,进而抑制了肿瘤细胞的侵袭和分泌MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9的分沁与肿瘤细胞侵袭性有密切关系。

柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与微线蛋白-2相互作用的鉴定

目的研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间的相互作用。方法以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtMIC2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtMIC2并转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况。原核表达GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白,纯化后进行GST-Pulldown试验。同时构建真核表达载体pcDNA3.1-HisEtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2并转染HEK-293T细胞,收集细胞裂解液,进行免疫共沉淀试验。在此基础上构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察转染细胞荧光发生情况。结果诱饵基因和捕获基因均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用,pGBKT7-EtAMA1/pGADT7-EtMIC2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统;原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtMIC2融合蛋白进行GST-Pulldown试验,二者可在体外相互作用;EtAMA1和EtMIC2可在HEK-293T细胞中共表达,免疫共沉淀试验进一步证实二者间的相互作用;双分子荧光互补技术验证EtAMA1和EtMIC2在细胞内存在相互作用。结论通过酵母双杂交、GST-Pulldown、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术验证柔嫩艾美耳球虫顶膜抗-1(EtAMA1)与微线蛋白-2(EtMIC2)之间存在相互作用,这为揭示微线蛋白在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础。

巨型艾美耳球虫微线蛋白3结构域蛋白的免疫保护作用

巨型艾美耳球虫是4种严重危害养禽业的鸡球虫之一。实验室前期研究发现,巨型艾美耳球虫微线蛋白3 (EmMIC3)能够与肠上皮细胞结合,经细胞ELISA、间接免疫荧光及子孢子侵入抑制试验发现,EmMIC3的5个结构域中EmMAR2与小肠上皮细胞结合能力最强,EmMAR5与小肠上皮细胞结合能力最弱。本研究经原核表达和纯化获得重组蛋白EmMIC3、EmMAR2和vMAR5,并制备了这3种蛋白的抗血清。通过分别注射重组蛋白和多克隆抗体评估3种蛋白抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护作用。结果显示:免疫EmMIC3、EmMAR2和EmMAR5均能够提高抗原特异性IgY抗体水平;重组蛋白免疫组中,EmMIC3和EmMAR2的抗球虫指数分别为180.70和70.82,而EmMAR5的抗球虫指数为137.69;重组蛋白抗血清免疫组中,EmMIC3和EmMAR2的抗球虫指数分别为180.49和164.60,而EmMAR5的抗球虫指数为137.37。上述结果表明,不管是重组蛋白免疫组还是重组蛋白抗血清免疫组,与对照组相比,EmMIC3和EmMAR2都具有明显的免疫保护效果,且MIC3的免疫保护效果最好,而EmMAR5则不具有免疫保护效果。结构域蛋白EmMAR2的免疫保护效果不及EmMIC3,启示虽然EmMAR2具有较好的免疫保护效果,但是要发挥更好的抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护效果,可能需要其他4种结构域蛋白的协同作用。