虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。

虾肝肠胞虫Taqman荧光PCR方法的建立与应用

为给虾肝肠胞虫(EHP)的监测和控制工作提供特异、灵敏的快速检测方法,针对EHP 18S相关保守序列设计1对特异性引物,优化并建立EHP的Taqman荧光PCR检测方法,同时验证该方法的重复性和敏感性。结果显示:体系扩增的最佳退火温度为60℃,构建好的质粒标准品标准曲线斜率为-3.195,R2为0.991;扩增产物阈值循环数(Ct)与标准模板起始量(X)的关系曲线为-3.195×Log(X)+36.923,扩增效率为105.59。使用所构建方法检测湛江市EHP流行情况,同时对样品进行白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、桃拉综合征病毒(TSV)、早期死亡综合症(AHPND)病毒检测。结果显示:样品的WSSV、IHHNV、TSV检测均为阴性;AHPND检出阳性率为10%,EHP为30%,其中1份样品的EHP和AHPND检测同为阳性。本研究建立的EHP荧光PCR方法具有特异、灵敏等优点。该方法及其临床应用数据可为EHP的防控提供技术参考。