低丰度蛋白Mlo的免疫金标记技术研究

小麦Mlo蛋白是一种低丰度蛋白。本文利用Mlo蛋白的2种抗血清对不同标记条件下的免疫胶体金标记情况进行了研究。结果表明,一抗结合时间对标记结果有影响,60 min的标记时间对Mlo蛋白定位比较合适;小麦Mlo蛋白IL2抗血清对Mlo蛋白的标记效果要比CT抗血清的标记效果好;IgG胶体金探针要比蛋白A胶体金探针更适合于对低丰度蛋白的检测。

TNF-α诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)能否诱导小鼠长骨骨样细胞株MLO-Y4发生程序性坏死及其发生机制。方法:将MLO-Y4细胞分为正常对照(control)组、TNF-α处理组、TNF-α+necrostatin-1(Nec-1)处理组、TNF-α+Z-VAD处理组和TNF-α+受体相互作用蛋白3(RIP3)-siRNA组。用流式细胞术检测各组细胞凋亡或坏死率,透射电镜鉴定细胞形态学变化,用Western blot法测定RIP1、RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平,应用激光共聚焦显微镜观察RIP1和RIP3蛋白的共表达,应用荧光标记法检测各组细胞活性氧(ROS)水平。结果:TNF-α诱导MLO-Y4细胞24 h,凋亡和坏死率明显高于control组(P<0.01)。与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能降低细胞的凋亡或坏死率(P<0.01)。在TNF-α组可见大量坏死样细胞,在Z-VAD组仍可见到坏死样细胞,而在Nec-1和RIP3-siRNA组未见到坏死样细胞。Western blot实验结果显示Nec-1可有效抑制RIP1蛋白表达,而Z-VAD对RIP1和RIP3蛋白表达无影响,RIP3-siRNA可有效降低RIP3蛋白表达(P<0.01)。与TNF-α组比较,Nec-1可有效降低RIP1-RIP3蛋白共表达阳性细胞百分率(P<0.01),而Z-VAD对其无影响。与control组相比,TNF-α组的ROS水平明显增高(P<0.01);与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P<0.01)。结论:TNF-α能诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死;ROS可能是MLO-Y4细胞程序性坏死的执行者。

利用Mlo蛋白质保守域MJ4-MrcD2区扩增小麦抗白粉病基因

利用Mlo蛋白质保守域设计兼并引物,以24个抗性不同的小麦品种为试验材料,采用抗病基因类似物(RGA)法探索小麦白粉病抗病基因快速有效筛选及利用的新方法。结果表明,所用的小麦抗病材料基因组DNA与兼并引物同源区的序列变化较感病材料大,导致扩增效率较低;兼并引物在抗病及感病材料中扩增结果类似,仅从这一结果无法判断扩增出的RGA与小麦白粉病基因间的关系,需要通过下游转化、克隆、测序来进一步筛选抗病相关RGA。

金银花MLO家族全基因组序列鉴定及表达分析

通过全基因组测序获得金银花MLO家族候选基因25个。生物信息学分析发现,该家族蛋白氨基酸数量为137~846,理论等电点在5.02~9.50之间,富含碱性氨基酸,有1个蛋白不含跨膜结构域,其他蛋白为3~10个。亚细胞定位预测结果显示,有21个蛋白定位于细胞膜上,1个定位于叶绿体。通过对金银花、小麦、拟南芥、番茄、普通烟草、林烟草和绒毛状烟草等物种的133个MLO蛋白构建系统发育树,显示金银花MLO家族蛋白可分为5个亚组。组织特异性分析发现,金银花MLO家族基因的表达具有明显的组织特异性。其中8个基因在叶中高表达,2个基因在茎中高表达,2个基因在花中高表达。接种白粉菌后,有4个基因显著上调表达,其中MLO14增加最多,比对照提高了2000多倍。本研究初步解析了金银花白粉病发生相关基因MLO的组成及表达情况,为进一步利用MLO作为靶基因,培育金银花抗白粉病新种质奠定了基础。

植物MLO蛋白研究进展

Mildew resistance locus O(MLO)蛋白是植物特有的一类蛋白家族,其中的部分成员是白粉病菌成功侵染寄主植物的必要因子。一个或多个MLO基因的功能缺失突变可赋予植物对白粉病菌广谱且持久的抗性,mlo介导的白粉病抗性在抗病育种中发挥了重要作用。植物中的MLO蛋白可以分为7个亚家族,除了参与植物与白粉病菌的互作外,不同亚家族的MLO蛋白还有很多其他功能。本文对MLO蛋白的特征、分类、功能进行了归纳,介绍了植物与白粉病抗性相关的mlo突变体特征及抗病机制,并对MLO基因的功能、作用机理研究及其在植物抗病育种中利用应注意的问题进行了讨论。

烟草NtMLO家族全基因组序列鉴定及表达分析

为系统鉴定普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组中白粉病感病基因NtMLO,通过构建已知拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Solanum lycopersicum)MLO蛋白保守结构域的隐马尔可夫模型,获得烟草MLO家族候选序列共29个,对序列进行了基础理化性质、亚细胞定位和系统发育等分析。基础理化性质分析结果显示,NtMLO蛋白序列长度范围为479~605个氨基酸,理论等电点在7.02~9.50之间,富含碱性氨基酸,跨膜结构域数量为5~7个。亚细胞定位结果显示,该家族蛋白均定位于细胞膜上。通过对拟南芥、番茄、普通烟草、林烟草(N.sylvestris)和绒毛状烟草(N.tomentosiformis)等物种的共计90个MLO蛋白构建系统发育树,显示烟草中的MLO基因可分为5个亚组。通过定量PCR分析了不同亚组的19个NtMLO基因的组织表达特异性,发现除NtMLO3和NtMLO5两个基因在花中没有表达、NtMLO26在叶中没有表达外,其余NtMLO基因在根、茎、叶片和花组织中均有表达。本研究为全面了解烟草基因组中MLO基因提供相关信息。